包涵体蛋白的纯化和复性

包涵体蛋白的纯化和复性 1．菌体的收集和破碎 用50 ml 离心管分别收集诱导表达后的培养物，8000 rpm 4℃离心10 min。沉淀用适量的超声破菌缓冲液重悬。 【备注】超声破菌缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.5 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mg/mL 溶菌酶） 重悬后的菌液于冰浴中进行超声波破碎，其条件为：功率为 300W，占空比 50%，每个循环30 s，总时间 20 min。破碎后的匀浆， 4℃、 12000 rpm 离心15 min。分别取上清液和沉淀进行 12% SDS-PAGE 分析，确定目的蛋白是否以包涵体的形式表达。 2．包涵体的处理 洗涤：沉淀用适量的包涵体洗涤缓冲液重悬后，搅拌洗涤 20~ 30 min，于 4℃，12000 rpm 离心15 min，弃去上清液。重复一次。再用适量的50 mmol/L Tris pH8.0 溶液洗涤一遍（以去除残留的EDTA），于 4℃ 12000 rpm 离心15 min，弃去上清液。 【备注】包涵体洗涤缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L 尿素，2％ Triton） 2％Triton X-100 溶液：量取 2mlTriton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)液，加 M 缓冲液 98ml即可。 溶解：沉淀用适量的包涵体溶解缓冲液重悬，室温搅拌 5-6 小时或过夜。12000 rpm 4℃离心15 min，收集上清液。 【备注】包涵体溶解缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L 尿素，0.2 mmol/L DTT 或 100 mmol/L β-巯基乙醇，2％Triton） 3．目的蛋白的纯化 亲和层析基于目的蛋白与固相化的配基特异结合而滞留，其他杂蛋白会流过柱子。 谷胱甘肽 S-转移酶（GST）是最常用的亲和层析纯化标签之一，带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化，但本方法有以下缺点：首先，蛋白上的 GST 必须能合适的折叠，形成与谷胱甘肽结合的空间结构才能用此方法纯化；其次，GST 标签多达 220个氨基酸，如此大的标签可能会影响表达蛋白的可溶性，使形成包涵体，这会破坏蛋白的天然结构，难于进行结构分析，有时即便纯化后再酶切去除 GST 标签也不一定能解决问题。 另一种可应用的亲和纯化标签是 6 组氨酸标签,组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍、锌和钴等金属离子，在中性或弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结合，在低pH 下用咪唑竞争洗脱。组氨酸标签与 GST 相比有许多优点：首先，由于只有 6 个组氨酸，分子量很小，一般不需要用酶切去除；其次，可以在变性...