细胞器的分级分离VIP免费

[目的要求]1．掌握差速离心法和密度梯度离心法的原理。2．熟悉哺乳动物细胞的细胞核、线粒体分离和纯化的实验方法。细胞器的分级分离[实验原理]球形颗粒的沉降速率取决于其密度、半径、介质黏度和离心力。差速离心法（differentialcentrifugation）是将细胞匀浆在密度均一的介质中从低速到高速离心，较大颗粒先在低速离心时沉淀，再用高速离心沉淀上清液中的小颗粒物质，从而达到逐级分离细胞器的目的。密度梯度离心法（densitygradientcentrifugation）是一定介质形成一连续或不连续的密度梯度，顶部的细胞匀浆在重力或离心力场的作用下分层、分离。一般先通过差速离心法将细胞器初步分离，再进一步通过密度梯度离心法分离纯化细胞器。细胞器的分离常通过组织细胞匀浆、分级分离和分析三个步骤完成。分级分离方法有两种，即：差速离心法和密度梯度离心法。[实验用品]1．器具：玻璃匀浆器、低速离心机、高速冷冻离心机、天平、普通光学显微镜、1.5mlEp管、载玻片、10ml滴管、冰盒、冰块、滤网、染缸、20ml烧杯。2．材料：大白鼠。3．试剂：生理盐水、PBS、0.25mol/L的蔗糖溶液、0.34mol/L蔗糖-0.5mmol/LMg(Ac)2溶液、0.88mol/L蔗糖-0.5mmol/LMg(Ac)2溶液、95％乙醇、甲基绿-派洛宁染液、丙酮、0.2％的詹纳斯绿B。[实验步骤]1．组织匀浆制备（1）取材将空腹12～24h的大鼠处死。剖开腹部，迅速取出肝脏，用预冷的生理盐水洗净血污，用滤纸吸干。（2）制备匀浆称取约1～2g左右的肝组织，用预冷的0.25mol/L的蔗糖溶液冲洗数次，剪碎。以预冷的0.25mol/L的蔗糖溶液悬浮剪碎的组织，移入匀浆器内，在冰浴条件下匀浆。匀浆完成后，用滤网过滤，即制得肝细胞匀浆，备用。2.细胞器的分级分离(1)细胞核的分离：第一次:1000rpm,8min。(2)细胞核的纯化在沉淀中加入0.34mo1/L蔗糖-0.5mmol/LMg(Ac)2至2ml，混悬。用长针头注射器在混悬液下轻轻加入2ml的0.88mo1/L蔗糖-0.5mmol/LMg(Ac)2溶液。尽量使两种溶液明显分层。2000rpm离心8min。加0.25M蔗糖至4ml，混匀第二次:1300rpm,8min。弃上清上清保留于试管1.0处重复1次显微镜下观察结果(3)细胞核鉴定：。分色:快速放入丙酮中，蒸馏水漂洗，擦干水分固定：浸入95％的乙醇溶液5min，晾干染色：滴加甲基绿-派洛宁染液染色15min涂片：在离心后的沉淀中加入几滴PBS，混匀后涂片，空气干燥(4)线粒体的分离将分离细胞核时收集的上清以10000g离心10min，将上清移入1.5mlEp管内并置冰上或4℃冰箱待用。沉淀用0.25mol/L的蔗糖溶液重悬后，10000g离心10min，重复1次，取沉淀。(2)线粒体的鉴定于洁净载玻片上滴1滴0.02％～1％的詹纳斯绿B染液，用牙签挑取线粒体沉淀均匀涂于染液中，染色5～10min，盖上盖玻片，镜检。[结果与分析]光学显微镜下观察，细胞核经甲基绿-派洛宁染色，DNA呈蓝绿色，核仁和胞质RNA呈红色。观察分析完整细胞核的数量及其比例。线粒体经詹纳斯绿B染色呈亮绿色。溶酶体可用酸性磷酸酶显示法鉴定。光镜下看不到溶酶体的形态特征，但可看到代表溶酶体的棕黑色颗粒或团块。如果分离到的细胞组分符合其形态学及酶学特征，而且没有其他组分的污染，则证明分离操作成功，反之则为失败。[注意事项]1．组织匀浆时，既要尽可能使细胞完全破碎，又要尽量快速。2．在细胞器分离过程中，所有操作应尽可能在1～4℃下进行。3．实验过程应注意保持细胞器的完整性，避免操作过于剧烈。另线粒体进行的是活体染色，要求样品制备好后尽快染色。[作业与思考题]1．分别在高倍镜和油镜下观察细胞核和线粒体，并绘制其结构图。2．简述细胞器分级分离的实验原理和主要步骤？3．实验操作中有哪些关键步骤和因素影响所得细胞器的含量和纯度？