目的基因双酶切和电泳纯化胶回收试验报告

四川大学实验报告1 / 11题目：目的基因双酶切和电泳纯化胶回收一． 实验目的 : 1.学习双酶切法获取目的基因片段的原理和方法；2.练习 DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。3.学习核酸琼脂糖胶回收的原理和方法。二． 实验原理1. 限制性核酸内切酶：生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶( 简称限制酶 ) 。2. 切割序列：（1）Bam HⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端：5' ? G↓GATCC ? 3' → 5' ? G GATCC ?3' 3' ? CCTAG↑G ? 5' → 3' ? CCTAG G ?5' （2）Eco RⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端：5' ?G↓AATTC ?3' → 5' ? G AATTC ?3' 3' ?CTTAA↑G ?5' → 3'? CTTAA G ?5' 3. 为什么要选择表达载体质粒pET-28a？pET原核表达质粒是最有效的原核表达系统之一。目的基因被四川大学实验报告2 / 11克隆到 pET质粒载体上，受噬菌体T7 强转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。宿主菌带有受lacUV5 控制的 T7RNA聚合酶基因，可以通过IPTG 来启动表达。充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的 50％以上。4. 限制性内切酶的选择：选择BamHI 、NotI 两个位点由于实验中须将质粒pEGFP-N3 上所需的目的基因切下并连接到载体质粒 pET-28a 上，所以选择的限制酶需满足以下几个要求：一．选择两种在质粒pEGFP-N3和载体质粒pET-28a 上都有酶切位点的限制性酶切酶，以保证切下的目的基因和载体质粒分别都有两个不同的末端，这样可以防止：（1）质粒和目的基因的自身环化；（2）质粒与质粒、目的基因与目的基因相互自身连接；（3）质粒与目的基因反向连接）二．两种限制性内切酶的酶切位点需满足：（1）不破坏目的基因；（2）在质粒 pEGFP-N3和载体质粒pET-28a 上都有且只有一个酶切位点；（3）在载体质粒上的切割位点距离尽量短些，并且不破坏载体质粒的启动子等关键序列。四川大学实验报告3 / 11载体质粒 pET-28a 和质粒 pEGFP-N3的酶切位点示意图：图一、 pET-28a 的酶切位点示意图图二、质粒 pEGFP-N3的酶切位点示意图图三、 pEGFP-N3 MCS多酶切位点示意图5. 琼脂糖凝胶回收（1）在酶切的过程中，除产生我们所需要的目的片段外，还会产生一些小片段，这些小片段可能会与载体连接，从而产生干扰...