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简述 cDNA文库构建的方法1． 1 mRNA纯化构 建 一 个cDNA文 库 的 第 一 步 是 分 离 在 某 一 给 定 的 组 织 或 细 胞 类 型 表 达 的mRNA 。mRNA 仅占细胞总RNA 的 1%～ 5% ，因而需要另外的纯化技术来富集mRNA 。从细胞总RNA 中分离mRNA 是根据实际上所有真核细胞mRNA 3’端有一长的伸展的腺嘌呤核苷，这个序列被称为poly(A) 尾巴，是mRNA分子特有的而其他主要RNA没 有 ， poly(A)尾 通 常 有 足 够 的 长 度 因 而 能 与 人 工 合 成 的 互 补 的 寡 脱 氧 胸 苷 酸（oligo(dT) ）杂交。正是这种特性使得mRNA 从 RNA 分子的混合物中分离出来。方法有三种：· 寡脱氧胸苷酸亲和层析：即分离mRNA 的标准方法，将一个寡脱氧胸苷酸（ 12~18碱基）连接到纤维素的亲和层析柱法，总RNA混合物上样后，mRNA与寡脱氧胸苷酸退火。非poly(A)RNA不结合并很容易从柱子洗去。用低盐缓冲液洗柱，己结合的mRNA 很快洗脱出来。· 溶液杂交：本方案也用寡脱氧胸苷酸－纤维素，但不用层析柱，而是将基质直接加到总RNA 溶液中。 退火和洗涤步骤通过离心含有RNA 沉淀的基质在溶液中完成。· 生物素标记寡脱氧胸苷酸和链霉亲和素包被磁性球珠：本方案中，一个生物素标记的寡脱氧胸苷酸酸引物在溶液中与总RNA退火，然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠，用磁分离器从大量溶液中分离球珠－mRNA 复全体。移去磁分离器，加入洗脱缓冲液，并重复磁性分离步骤。在无盐的状态下，寡脱氧胸苷酸引物从mRNA上解离。1.2cDNA的合成与克隆1.2.1 cDNA第一条链的合成所有合成cDNA第一条链的方法都要用依赖于RNA的 DNA聚合酶（反转录酶）来催化反应，有两个关键的因素，一个是mRNA 模板，另一个反转录酶。目前商业化的反转录酶主要有两种：一种是禽源反转录酶(reverse transcriptase)，另一种是鼠源反转录酶。两种酶都无3’－ 5’外切酶活性，但禽源反转录酶有很强的RNAase H酶活性，鼠源的具有相对较弱的RNAaseH 酶活性。RNAase H酶活性在反应中起负作用，可降解mRNA分子末端的poly(A) 序列和cDNA-RNA杂交分子中的RNA 。因此一般反转录过程都是采用鼠源反转录酶。GIBCO-BRL公司出品一种鼠源反转录酶，称为SUPERSCRIPT反转录酶，缺少C-末端 180 个氨基酸，完全去除了其RNAase H酶活性，保持完整的DNA 聚合酶活性。1.2.2 cDNA第二条链的合成合成cDNA第二条链的传统方法是“自身引...