结核分枝杆菌培养、药敏实验及质量控制2007-10-112结核菌培养结核菌培养酸性罗氏培养管上结核分枝杆菌菌落结核分枝杆菌显微镜下形态2007-10-115培养目的：一：增加分枝杆菌生产率，早期生长、早期诊断；二：提高阳性率，使少数细菌亦能生长出来；三：进一步进行药敏试验和菌型鉴定。2007-10-116培养•敏感性、特异性更强,,理论上10-100条菌/毫升可检出阳性；•获得分枝杆菌培养物，是进一步检测的基础•需时长,根据接种量的大小，一般2-8周才能得到肉眼可见菌落。•需要培养箱、涡旋振荡器、培养基凝固器等设备•相对涂片技术要求较高•成本是直接涂片法的7-8倍。•据2001版伯杰金氏手册，结核杆菌现属于新成立的放线菌门、放线菌纲、放线菌亚纲、放线菌目、棒杆菌亚目、分支杆菌科结核分枝杆菌（MTb）结核病的病原体•1882年郭霍（RobertKoch）发现•繁殖时有分支生长的趋势，故称分支杆菌•具有抗酸性,又称抗酸杆菌,用抗酸染色的方法检查分枝杆菌•分枝杆菌有致病性和非致病性两大类•主要引起肺結核的致病性分枝杆菌有人型、、牛型、、非洲、、田鼠分枝杆菌二、痰涂片镜检标准化操作结核杆菌（MTb）形态(杆菌型)结核分支杆菌是专性需氧菌，无鞭毛、荚膜，无运动能力；•结核杆菌在痰液中多为单个存在或形成分枝，有时呈V、Y、人字形排列，痰菌量多时可排列为束状或集聚成团。•结核分枝杆菌由细胞壁、细胞膜、细胞质、核物质组成。•菌体内可有2-5个或更多的小圆形易染颗粒，异染颗粒可超过菌体横径。显微镜下结核分支杆菌形态结核分枝杆菌显微镜下形态2007-10-1112结核分枝杆菌生长特性：缓慢：在一般培养基上分裂一代需要10多小时，一般10-30天肉眼可见菌落生长。菌落形态（罗氏培养基）：粗糙、凸起、致密，有表面皱折，呈颗粒、结节或菜花样，浅黄色或米色，不透明。2007-10-11132007-10-1114基本步骤：基本步骤：制备培养基标本前处理（去污染）接种孵育报告结果2007-10-1115酸性罗氏（Lowenstein-Jensen）培养基天门冬素3.6g或谷氨酸钠（纯度99%以上）7.2gKH2PO414.0gMgSO4.7H2O0.24g枸橼酸镁0.6g丙三醇12ml蒸馏水600ml新鲜鸡卵液1000ml2%孔雀绿20ml一、培养基2007-10-1117原理：分枝杆菌对酸碱有相对强的耐受力。目的：液化标本、去除杂菌、分离出分枝杆菌原则：-尽可能杀灭标本中的杂菌-尽可能保存标本中的分枝杆菌二、标本前处理2007-10-1118操作痰标本痰标本11－－22倍倍4%NaOH4%NaOH振荡匀化静置15分钟2007-10-111937℃竖直培养8周均匀接种0.1ml,2支/标本斜面向上，37℃水平放置24小时三、接种和孵育2007-10-1120•接种后第3、7天各观察一次菌落生长情况•此后每周观察一次，直至满8周•记录菌落生长及污染情况。四、结果的观察与报告2007-10-1121报告方式分枝杆菌培养阴性：斜面无菌落生长菌落生长不足斜面面积1/4者，报实际菌落数。分枝杆菌培养阳性（1+）：菌落生长占斜面面积的1/4分枝杆菌培养阳性（2+）：菌落生长占斜面面积的1/2分枝杆菌培养阳性（3+）：菌落生长占斜面面积的3/4分枝杆菌培养阳性（4+）：菌落生长布满整个斜面2007-10-1122分离培养流程:涡旋振荡2-3次痰标本中加入1-2倍体积4%NaOH分别接种0.1ml前处理液至2只培养基斜面接种后3天、7天观察，此后每周观察一次置37oC温箱培养有菌落生长需经抗酸染色确认，至第8周无菌落生长报告阴性室温静置15分钟43256712007-10-1123可能原因解决方法标本保存不当(时间、温度）涂片后标本于冰箱保存，24小时内培养。标本选择不当选择标本中脓样、干酪样可疑部分过处理（时间、浓度)4％NaOH，1－2倍体积，20分钟接种量太小每管接种0.1毫升温箱温度不当温箱内置温度计，每日监测温度。涂阳培阴率过高？2007-10-1124可能原因解决方法标本保存不当(时间、温度）涂片留取后24小时内培养，不能及时培养的4oC冰箱保存。前处理不充分4％，1－2倍，充分混旋，20分钟。材料灭菌不佳接种用吸管需高压灭菌。操作不当培训，严格按操作规程操作。培养基因素统一供应，4oC直立保存，1个月内使用污染率过高？2007-10-1125菌种保存原则：一个有利的休眠环境，干燥、低温、缺氧、缺乏营养和添加保护剂等。一：长...
