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第三章免疫分析第三章免疫分析第一节免疫分析法概述第一节免疫分析法概述一、抗原基本概念与性质1.抗原和抗原的两种性能抗原：指能够刺激机制免疫系统发生免疫应答，产生抗体和/或致淋巴细胞，并能与之特异性结合、发生免疫反应的物质。免疫原性：指抗原能够刺激机体免疫系统发生免疫应答、产生抗体和/或致敏淋巴细胞的功能。免疫抗原性（免疫反应性或反应原性）：指抗原能与相应抗体和/或致敏淋巴细胞特异性结合、发生免疫反应的性能。抗原决定簇：存在于抗原分子表面的能够决定抗原特异性的特殊化学基因，又称表位。抗原特异性取决于抗原决定簇，即由抗原决定簇的种类、性质、数目和空间构型决定。2.抗原决定簇(antigenicdeterminant)TD抗原（大分子蛋白质）TI抗原（多糖）3.抗原结合价抗原结合价：是指一个抗原分子上能与相应抗体发生特异性结合的抗原决定簇的总数。两种不同的抗原分子上所具有的相同或相似的抗原决定簇称为共同抗原或共有决定簇，亦称交叉反应性抗原。4.共同抗原抗体的概念：机体受抗原刺激后产生的，并且能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。二、抗体基本概念及其性质IgG的一级结构抗原抗体反应：指抗原与相应杭体之间所发生的特异性结合反应。抗原抗体反应的特点：特异性、可逆性、比例性。特异性：比例性：三、抗原抗体反应抗原的特异性取决于抗原决定簇的数目、性质和空间构型，而抗体的特异性则取决于抗体IgFab段的可变区与相应抗原决定簇的结合能力。1:24/81.5:112/84:116/4可逆性：抗原与抗体通过很弱的短矩引力而结合，如范德华引力、静电引力、氢键及疏水性作用等。第二节、酶联免疫吸附试验（ELISA）第二节、酶联免疫吸附试验（ELISA）•酶联免疫吸附试验（ELISA）：结合在固相载体上的抗原（抗体）与待检抗体（抗原）酶偶联物（标记物）反应后，催化水解或氧化还原酶的相应底物呈色，其颜色深浅与待测抗原（抗体）含量成正比。一、原理及特点一、原理及特点特点：灵敏度高、特异性强、准确性好；酶标记试剂能够较长时间保持稳定；操作简便、对环境没有污染；易与其它技术偶联；衍生出适用范围更广的新方法。二、ELISA常规技术二、ELISA常规技术•常规使用的ELISA技术主要有：直接法（directELISA）：测抗原间接ELISA：测抗体双抗体夹心ELISA：测抗原双位点一步法：测抗原竞争ELISA：测抗体或抗原及半抗原1.直接法（directELISA）•将抗原直接固定在固相载体上，加入酶标记的抗体，加底物显色测定。即可测定抗原总量，此抗体的特异性非常重要。•优势：操作手续简短，因无须使用二抗可避免交互反应。•缺点：试验中的一抗都得用酶标记，但不是每种抗体都适合做标记，费用相对提高。包被抗原加酶标抗体洗涤加底物和显色洗涤2.间接ELISA•基本原理：利用酶标记的抗球蛋白抗体（第二抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体。•主要用于对病原体抗体（一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体）的检测而进行传染病的诊断（如抗HBc、抗HBe）抗原包被间接ELISA法示意图洗涤加一抗洗涤加酶标二抗洗涤加底物和显色3.双抗体夹心ELISA3.双抗体夹心ELISA•基本原理：将包被在微量反应板上的已知抗体与待检抗原进行反应，再加上酶标抗体和底物，通过显色反应对抗原进行定性或定量。此法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原。•此法适用于多价大分子抗原检测，而不能用于测定半抗原等小分子物质。双抗体夹心ELISA（测抗原）4.双位点一步法ELISA4.双位点一步法ELISA•基本原理：应用针对抗原两个不同决定族的两种单抗分别作为固相载体包被和酶标抗体，待检测抗原和另一个经酶标记单抗同时加入，形成固相单抗－待检抗原－酶标单抗复合物，加入底物显色后，根据颜色深浅对待检抗原进行定性或定量。5.竞争ELISA5.竞争ELISA•竞争法测抗体：待测抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。•竞争法测抗原：待测抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，结果如待测抗原含量越多，与固相抗体结合的酶标抗原就越少，显色越...