试验一CTABNaCl法细菌基因组DNA提取

实验一 CTAB/NaCl 法细菌基因组 DNA 提取一、培养基A. LB 培养基（ 1L）胰蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g pH 调至 7.0 二、菌种大肠杆菌野生型三、缓冲液A. 1M Tris-HCl ( pH 8.0, 1L) 1.称量 121.1 g Tris 置于 l L 烧杯中，加入约800 ml 的 ddH2O，充分搅拌溶解，加浓HCl 约 42ml，将溶液定容至 1 L。C. TE 缓冲液（ pH 8.0）10 mmol/L Tris-Cl (pH8.0) ，1mmol/L EDTA (pH8.0) D. 10% SDS 溶液10 gSDS，定容至 100ml E. CTAB/NaCl 缓冲液CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml ( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml 先用 70ml ddH2O 溶解, 再定容至 200ml 灭菌，冷却后0.2-1% β-巯基乙醇（ 400ul）。F. 5mol/L NaCl 溶液292.5 gNaCl 了，定容至 1L G. 氯仿：异戊醇（ 24：1）480ml 氯仿 +20ml 异戊醇，混匀存放至棕色瓶备用。H. 酚：氯仿：异戊醇（ 25：24：1）250mlTris 饱和酚 +240ml 氯仿+10ml 异戊醇，混匀存放至棕色瓶备用。I. 上样缓冲液（ 6×）0.25%溴酚蓝， 20%蔗糖J. 电泳缓冲液（ 1×, 1L）Tris 碱 10.8g，硼酸 5. 5g，0.5mol/L EDTA （pH8.0）4ml, 用 ddH2O 定容至 1L。K. 0.7%琼脂糖凝胶（ 100 ml）0.7 g 琼脂糖凝胶 , 加入 1×电泳缓冲液，微波炉加热至凝胶完全融化即可三、实验具体步骤1、接种一单菌落于5mlLB 中, 30℃培养过夜 , 2、取 1ml 种子培养液接入100ml LB 中, 37℃、 220r/min 培养 16 小时; 3、5000r/min 离心 10 分钟,弃去上清。4、加入 10mlTE 离心洗涤后 ,用 10mlTE 溶解菌体 ,混匀。5、取 1.4ml 菌悬液 ,加入 73.6μ l10%SDS,混匀,加入 14.8μ l10mg/ml蛋白酶 K, 混匀 , 37℃温育 1 小时6、加入 296μ l 5mol/LNaCl, 再加入 204.8μ lCTAB/NaCl,混匀 ,65℃温育 10 分钟。（注：总体积约2ml）7、加入等体积的氯仿 /异戊醇 ,混匀 ,10000r/min 离心 5 分钟 ,保留上清。8、上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),混匀,10000r/min 离心 5 分钟,保留上清。9、加入 0.6 倍体积的异丙醇 ,混匀,10000r/min 离心 5 分钟,收集 DNA 沉淀 ,用 70%乙醇离心洗涤 DNA沉淀,10000r/min 离心 5 分钟，弃上清液，沉淀即总DNA 。10、用 1mlTE 溶解 DNA, 取 5μ l在琼脂糖电泳中上样检测。