试验报告目的基因与载体的连接转化及工程菌导入表达并PCR验证

四川大学实验报告1 / 13题目：目的基因与载体的连接转化及工程菌导入表达并PCR验证。一． 实验目的 : 1.学习目的基因连接转化载体的原理和方法。2.学习制备感受态细胞并将质粒导入工程菌的原理和方法。3.学习菌落 PCR鉴定阳性克隆的方法和步骤二． 实验原理1. DNA 的连接重组：具有相同粘性末端的两段DNA分子在 DNA连接酶的作用下可以连接在一起。因为相同的粘性末端同一通过碱基互补配对形成一个相对稳定的结构。连接温度的选择，理论上的最适温度是连接酶的最适温度---37 摄氏度，但是该温度下粘性末端形成的配对结构稳定，所以在室温下（ 12~16度）既可最大限度发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构的稳定。2. 感受态细胞的制备：将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时 Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞，细胞膜通透性发生变化，极易与外源 DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。联合其它的二价金属离子（如Mn、Co）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100～1000 倍。3. 质粒的导入在冰上融化感受态细胞，经过42 度短暂热激后，由于细胞膜处于液晶态产生裂缝，外源DNA黏附于细胞表面，而后立即冰浴，促使细胞膜愈合。然后将菌体放入适宜的培养基中培养，以促进细胞的愈合恢复。四川大学实验报告2 / 134. 阳性转化的培养基筛选方法。普通的大肠杆菌难以在含有Kana的 LB培养基上存活繁殖，但由于载体质粒含有Kana霉素的抗性基因，所以成功导入载体质粒的大肠杆菌能够在含有Kana的 LB培养基上形成菌落，即转化阳性，但是由于成功导入的质粒不一定携带了目的基因，所以可能会出现伪阳性，故需要进行 PCR鉴定。5. 菌落 PCR的原理通过目的基因的引物进行菌落PCR，如果菌体成功导入了目的基因，则能够通过PCR获取大量目的基因片段，而不含有目的基因的菌落不会扩增出目的基因片段。从而将阳性与伪阳性菌落区分开。三． 实验材料及设备1.实验材料：（1）已完成酶切的载体与目的基因片段。DNA连接酶，缓冲液等。（2）冰冻的感受态DH5a大肠杆菌。2.实验仪器：（1）恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、100、1000μ L 取液器各一支，台式高速离心机，制冰机，漩涡器；（2）电泳仪， 电泳槽， 样品槽模板 （梳子），有机玻璃...