连接转化攻略

连接转化攻略双酶切连接反应之全攻略双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用 2 周重组了 14 个质粒。现就自己的体会， 结合丁香园战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。1、回收 PCR 产物：在进行 PCR 扩增时候，给引物两端设计好酶切位点， 一般说来， 限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶， 如 BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER ，以及各酶在公用 BUFFER 里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：http://img.dxy.cn/upload/2006/08/13/31219184.pdf。双酶切时间及其体系： 需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实 1 个小时已经足够。应用大体系，如 100 微升。纯化问题：纯化 PCR 产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准， 很容易割下大块的胶，影响纯化效率。 现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此， 酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以， PCR 产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA 的纯化柱试剂盒酶量的问题：以 TAKARA 的为例，其对 1 单位酶的定义如下：在50 μ l 反应液中， 30 ℃温度下反应 1 小时，将 1 μ g 的 λ DNA完全分解的酶量定义为 1 个活性单位 (U) 。 而该酶浓度约为 15 单位 / 微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解 15μ g 的 DNA ，而一般从 1-4ml菌液提出的 DNA 约为 3μ g，而 PCR 纯化后的产物（50 体系）约为 3μ g，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。2、酶切、回收后的PCR 产物与载体的连接摩尔比的计算， 很多人凭经验也可以。 但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的 PCR 产物片段 =1 ：10，一般取前者 0.03pmol，后者取 0.3pmol。pmol 为单位的 DNA 转换为为 μg 单位的 DNA ：（X pmoles× 长度 bp× 650 ）/ 1,000,000 （注：长度 bp×650 是该双链 DNA 的分子量）所得数值即为 μg, 也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66 μ g,如载体是5380bp ，则 0.03pmol为0.03 ×5.38 ×0.66=0.106524μg。测 DNA 浓度可以在专用机子上测， 注意 OD 值，一般约 1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER 进...