24/10/23PCR和实时荧光定量PCR简介PCR的定义•PCRPolymeraseChainReaction，即“聚合酶链反应”，它是指在DNA聚合酶的催化作用下，以母链DNA为模板，通过变性、退火、延伸，复制出与模板DNA互补的子链DNA的过程。DNA的复制(replication)——由亲代DNA合成两个相同的子代DNA的过程。复制母代DNA子代DNAPCR的基本原理AGAACTTTCTTGAAAGAACTTTCTTGAATCTTGAAAGAACTT母代DNA子代DNAPCR的基本原理PCR反应的成分：模板DNA、引物、DNA聚合酶、4种dNTP、反应缓冲液、Mg2＋PCR反应的基本步骤：变性：加热使双链DNA变为单链（95,30℃s）退火：降温使引物和互补模板在局部形成杂交链（50,30s℃）延伸：耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物为起始点的延伸反应（70,30s℃）PCR的准备•引物的设计•模板的制备在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，在引物一模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环。多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。PCR产物的积累规律PCR产物的积累规律示意图PCR反应条件一、反应体系标准PCR反应体积为50~100μl,其中含有缓冲液，4种底物，引物，DNA模板和耐热DNA聚合酶。二、反应步骤加入各种试剂，95C热变性5~10分钟，使模板DNA充分变性，同时除去蛋白酶，氯仿对耐热DNA聚合酶的影响。然后加入2UTaqDNA聚合酶，加50μl液体石蜡封盖反应体系，防止液体挥发。进行PCR反应。(如有热盖设计的PCR仪则不需要加入液体石蜡)三、循环参数•变性温度和时间：按模板DNA复杂程度来调整变性温度和时间。94℃，1min；95℃，30s；97℃，15s；•退火温度和时间：45~55℃，30s~1min•延伸温度和时间：72℃，时间因扩增片段的长度而异：1kb，1min；3~4kb,3~4min•循环次数：25~30次，视最初靶分子浓度而定•两步PCR：将退火和延伸温度合并为一个温度，采用二温式两步PCR四、反应缓冲液10~50mmol/LTris-HCl缓冲液，72℃时pH7.2,调节反应体系的pH值，使TaqDNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。缓冲液含50mmol/L的KCl可促进引物退火，大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构。镁离子浓度：常用1.5mmol/L五、底物浓度：20~200μmol/L•dNTP溶液具有较强的酸性。使用时应用NaOH将pH值调至7.0~7.5，分装小管，于-20℃存放，过多冻融会使dNTP产生降解。•在PCR反应中，dNTPs浓度在20~200μmol/L,dNTP浓度过高可加快反应速度，同时还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。反之，低浓度的dNTP会导致反应速度的下降，但可提高反应的特异性及实验的精确性。4种dNTP在使用时必须以等摩尔数浓度配制，以减少错配误差和提高使用效率。六、TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶在75~80℃具有最高的聚合酶活性。75~80℃每个酶分子每秒可延伸约150个核苷酸，70℃时延伸速度在60个核苷酸/秒以上。55℃时为22个核苷酸/秒；37℃和22℃时分别为1.5个和0.25个核苷酸/秒。温度超过80℃时，合成速度明显下降，可能与引物和模板结合稳定性遭到破坏有关。七、引物：0.1~0.5μmol/LPCR反应引物浓度为0.1~0.5μmol/L,引物与模板的摩尔比至少为108：1。如此过量的引物才能确保模板DNA一旦变性就与引物退火，而不能与其自身退火。但引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，且可增加引物之间形成二聚体的几率，降低扩增效率。但如果该比例太低，PCR效率也会降低。八、模板：0.1~0.5μmol/L在一定范围内PCR产量随模板浓度的升高而显著升高，但模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。为保证反应特异性，一般采用微克水平的基因组DNA或102105拷贝的待扩增片段作为模板。PCR产物的检测一、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是PCR扩增产物的分离、纯化和鉴定最常用的方法。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，用溴化乙锭(EB)染色，在紫外灯...
