PCR技术及其医学应用精VIP免费

PCR技术及其医学应用武汉大学医学院病毒所分子生物学研究室PolymerasechainreactionThepolymerasechainreaction(PCR)：toamplifyasequenceofDNAusingapairofprimerseachcomplementarytooneendofthetheDNAtargetsequence.1985年，美国Cetus公司和加利福尼亚大学联合创建了一种核酸体外扩增技术。第一节PCR原理与特点一、PCR基本原理PCR是一种选择性扩增DNA或RNA的方法，其基本原理是依据体内细胞分裂中的DNA半保留复制机理，以及在体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链；单链DNA与人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。高温变性，低温退火，适温延伸等３步反应循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。•Denaturation（变性）:ThetargetDNA(template)isseparatedintotwostandsbyheatingto95℃•Primerannealing（引物退火）:Thetemperatureisreducedtoaround55℃toallowtheprimerstoanneal.•Polymerization(elongation,extension):Thetemperatureisincreasedto72℃foroptimalpolymerizationstepwhichusesupdNTPsandrequiredMg++HowPCRworksPCRproceedsbysequentialcyclesof:1.DNAdenaturationThesampleDNAisdenaturedwithheattoformsinglestrandedDNA.与体内DNA解链过程不同，PCR中作为模板的双链DNA是通过95℃左右的高温使其产生变性，形成单链DNA而游离于反应溶液中。2.单链DNA模板与引物退火(annealing)TheprimersareannealedtothesinglestrandedDNAbycoolingthesample.通常需要两个寡核苷酸作DNA合成的引物(primer)，这两个引物分别与待扩增顺序两侧的模板DNA互补，在降低温度的过程中，通过控制退火条件，引物就能准确地配对在扩增区域的两侧。Primers引物•PCRprimers：about18to30ntlongandwithsimilarG+Ccontents.•Tm=2(a+t)+4(g+c):determineannealingtemperature.Iftheprimeris18-30nt,annealingtemperaturecanbeTm5oC3.引物的延伸(extension)TheprimersareextendedinthepresenceofDNApolymeraseanddeoxyribonucleosidetriphosphates,andcomplementarycopiesofthetargetDNAisproducedPCR在PCR反应体系中的DNA聚合酶，能够催化反应体系中游离的单核苷酸(dNTP)按引物5'-3'方向，按碱基配对的原则延伸，形成两条与模板DNA互补的半保留复制链，新合成的链又作为下轮循环反应的模板。EnzymesforPCR•ThemostcommonisTaqpolymerasefromThermusaquaticus.Ithasno3’to5’proofreadingexonucleaseactivity.Accuracyislow,notgoodforcloning.Thecycleisthenrepeated以上“变性、退火、延伸”三步曲，被确定为PCR的一轮循环，整个PCR过程一般只需30个循环.•ThisprocesswillamplifytheoriginalDNAexponentiallysothatabout1millioncopiesoftheoriginalsequencearepresentafter20cycles(220),and1billionarepresentafter30cycles(230).PCR的扩增倍数为(1+x)n，x为扩增效率，平均为75％，n为PCR的循环次数。尽管PCR扩增DNA非常有效，但目的DNA顺序的指数扩增并不是一个无限制的过程。通常在正常的反应条件下，经30次循环之后，酶的催化反应趋于饱和，就会出现“平台效应”，产物的量不再增加。“平台效应”出现的迟早还取决于酶的性能，模板DNA的拷贝数，底物dNTP浓度及多种因素。二、PCR技术的特点1.高度的敏感性单拷贝基因经25次循环后，其基因拷贝数也在一百万倍以上，即可将极微量(pg级)DNA，扩增到紫外光下可见的水平(μg级)。它可对单拷贝基因、单个细胞、单根头发、一滴血等微量标本进行分析。2.高度的特异性PCR扩增的特异性依赖于两个引物设计的特异性，依赖于引物与模板结合的正确性。PCR反应时退火的温度对特异性也有影响.在PCR实验中，只要引物设计合理，反应温度适宜，采用高温启动法PCR扩增的特异性是相当高的。3.操作简便、快速4.适用样品的广泛性既可是DNA，也可是RNA；既可是纯化的，又可是粗制的；既可是新鲜组织，也可是陈旧样品；既可是细胞(刮片细胞、培养细胞、血细胞），又可是体液（大小便、血清、淋巴液等）；既可是完整的大分子，...