蛋白研究方法VIP免费

MethodsinProteinChemistryYongChenSIBCBContents•Introductiontoproteinscience•Methodsforprotein-propertycharacterization•Methodsforproteinpurification•Methodsforprotein-interactioncharacterization•Methodsforprotein-structurecharacterizationProteinScienceProteinScienceTheFrontierofLifeSciencesinTheFrontierofLifeSciencesinPost-GenomeEraPost-GenomeEra蛋白质旧称“朊”，是由氨基酸组成的有机化合物。荷兰化学家穆尔德（GerardusJohannesMulder,1802-1880)什么是蛋白质蛋白质是生物体最重要的组成成份和生命活动最基本的物质基础，是最主要的生命活动载体和功能执行者。蛋白质是生命活动的物质基础和功能执行者核孔复合物物质运输物质代谢与能量产生ATP酶微管微丝细胞骨架凋亡与衰老端粒酶免疫应答胞内信号通路神经信号传递转转转转转转录调控蛋白质科学研究的意义蛋白质研究涉及生物复杂系统的各个层次原子蛋白质蛋白质复合物细胞组织个体空间尺度10-12m10-9m10-8m10-5m10-2m时间尺度分子事件10-6s细胞信号转导10-3s细胞运动100s细胞分裂103s个体寿命106s>10-1m蛋白质科学进入新时代Ensemble--->Singlemolecule/cellStatic--->DynamicInvitro--->Invivo纳米抗体技术脂立方相结晶技术高产量哺乳细胞表达技术单分子技术多维核磁共振技术超分辨率显微成像技术冷冻电镜技术原位解析自由电子激光技术超尺度解析动态解析高分辨生物质谱技术生物膜干涉技术微秒级分子动态模拟技术无细胞蛋白质表达技术时间分辨X射线衍射技术小角散射技术9新技术是蛋白质科学发展的推动剂BasicfeaturesofproteinsYongChenSIBCB一级结构四级结构三级结构二级结构蛋白质的结构组成蛋白质的一级结构氨基酸LDThe"CORN"rulefordeterminingtheD/LisomericformofanaminoacidSelenocysteineSec,UUGAcodonPyrrolysinePyl,OUAGcodon蛋白质的一级结构氨基酸种类蛋白质的一级结构肽多肽蛋白质的二级结构α螺旋(n)C=Oformsahydrogenbondwith(n+4)NH2蛋白质的二级结构310螺旋π螺旋蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构β-折叠（平行，反平行，混合）蛋白质的超二级结构（motif）蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构1.Bury(sufficient)hydrophobics2.Notcreate(too)manycavities3.Satisfy(most)hydrogenbonddonorsandacceptors4.Pampertheburiedcharges5.Avoid(most)sidechainandmainchainstrain结构特点蛋白质的四级结构蛋白质分子或复合物的多亚基结构和分子聚合体蛋白质特点总结蛋白质是由氨基酸按照特定序列连接通而成的生物大分子；具有一定的分子质量和电荷，复杂的分子结构和生物学功能。MethodsforBiochemicalCharacterizationofproteinsYongChenSIBCBProteinCharacterization1.AminoAcidcomposition2.Molecularweight3.Concentration4.Isoelectricpoint(charge)5.Stability6.Structure7.ModificationProteinCharacterizationAminoAcidcompositionHPLCanalysisProteinscanbeseparatedintopeptidesbyproteolyticdigestionTrypsinKETAAAKFERQHMDSSTSAASSSNYCNQMMKSRNLTKDRCKPVNTFVHESLADVQAVCSQKNVACKNGQTNCYQSYSTMSITDCRETGSSKYPNCAYKTTQANKHIIVACEGNPYVPVHFDASVPeptidesequencingMassspectrometryanalysesgivemassandidentityofpeptidesProteinCharacterizationMolecularweightanalysisStaticlightscatteringMeasureproteinconcentrationGoldenstandardNitrogencontent(16%)KjeldahltestRegularlyusedmethods:UVabsorptionat280nm(aromaticresidues:W&Y);205-220nm(peptidebond)Dyebinding(Bradford)Bis-cinchonicacid(BCA)reagentLowry-Folin-CiocaleaureagentBiuret-alkalinecopperreagentProteinCharacterizationChargeanalysispIIsoelectricFocusing•ProteinsareloadedontoagelthathasagradientoflowtohighpHvalues.•Avoltageisappliedtothegel.•ProteinsmigrateuntiltheyreachapHinwhichtheyhaveanetchargeof0(definedastheisoelectricpointorpIvalue).ChargeanalysisProteinexpressionprofileanalysisProteinCharacterizationProteinstabilityThermalshiftassayProteinstabilityDifferentialScanningCalorimetryProteinstabilityNanodifferentialscanningfluorimetry（NanoDSF)NanoTemperPrometheusProteinsecondarystructurecirculardichroism（CD），圆二色StructuralanalysisMaintechniquesinStructuralBiology•X-raymacromolecularcrystallography•Solutionnuclearmagneticresonance(NMR)•Electroncryomicroscopy(Cryo-EM)•Theoreticalmodeling•Others:smallangleX-rayscattering,electrondiffraction,massspectrometryetc.ProteinCharacterizationProteinmodificationProteinmodificationdetectedbyMSSummaryWegiveabriefoverviewofbiochemicalmethodsforcharacterizationofproteins.Developingnewmethodsisneverstopped!