第五章DNA的体外重组与基因转移VIP免费

第五章DNA的体外重组与基因转移目的基因获得了,载体也选好了，下一步的工作就是将目的基因连接到载体上形成一个重组DNA分子并导入细胞。第一节重组DNA分子的构建基因重组是依赖于限制性核酸内切酶、DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对外源目的基因的片段和表达载体DNA进行适当切割和修饰后，将外源片段和表达载体巧妙的连接起来，再转入受体细胞，实现目的基因在受体细胞内的正确表达。一、在外源目的基因与表达载体连接的重组过程中，一般需要考虑到以下几个因素：•实验步骤简单易行，连接效率较高，易于重组子筛选；•重组DNA分子，应能被一定的限制性核酸内切酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段；•外源基因必须在表达载体DNA的启动子控制之下，并置于正确的阅读框架之中，以便目的基因的高效表达；二、载体DNA与外源基因片段的连接DNA体外重组所需要的材料为：载体、目的基因、限制性内切酶和连接酶。载体的选择要根据宿主细胞的类型和目的基因的长短。限制性内切酶的选择要根据载体上和目的基因上是否有其切点，而且切点必须是单一的。常见的连接方式有：①粘性末端连接法；②平头末端连接法；③人工接头连接；④同聚物加尾连接等。连接反应的实质连接反应的实质是连接酶对两个片段末端之间的催化反应，因此连接酶是连接反应的关键因素。连接反应常使用T4DNA连接酶，T4DNA连接酶对片段间粘性末端的催化活性很高，特别是在10%PEG存在时活性更高。T4DNA连接酶对平头末端也可进行连接，只是连接效率远远低于粘性末端的连接效率。二、载体DNA与外源基因片段的连接（一）粘性末端连接法粘性末端连接可分为同一限制酶切位点连接、不同限制酶切位点连接两种方法。1.同一限制酶切位点连接①概念同一限制酶切位点连接，是指同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端，在连接酶的作用下，相互配对的粘性末端间形成磷酸二酯键。这种连接方式可用于DNA片段和DNA片段的连接，也可用于载体和DNA片段的连接。（一）粘性末端连接法1.同一限制酶切位点连接②举例如：质粒载体用EcoRⅠ切割后，环状质粒就被切成具有EcoRⅠ粘性末端的线性质粒；如果外源基因也用EcoRⅠ切割，并混于上述粘性末端质粒溶液中反应，则目的基因的两端就会与线性载体两端的粘性末端互补配对，在连接酶的催化下形成共价连接的环形重组质粒。如下图所示（一）粘性末端连接法1.同一限制酶切位点连接③存在问题这种连接方式中，不可避免地会形成载体DNA的自连和目的DNA的自连，因此，实际操作中必须控制自我环化现象的发生。④解决方法通过调节连接反应中外源DNA和载体DNA浓度可以限制载体DNA自身环化；（一）粘性末端连接法1.同一限制酶切位点连接④解决方法一般用碱性磷酸酶处理酶切后的质粒载体，此酶能够水解DNA或RNA的5´末端的磷酸基团，使原来的磷酸基团变成羧基。由于质粒载体两端都是羧基，失去了互相共价连接的能力、也就不能自身环化。而未被碱性磷酸酶处理的目的基因与载体DNA之间依然具有共价连接能力，可以形成重组分子。（一）粘性末端连接法2.不同限制酶切位点连接①概念由两种不同的限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有相同类型的粘性末端，它们的末端之间形成碱基互补配对，并在连接酶的作用下形成共价连接的重组DNA分子。（一）粘性末端连接法2.不同限制酶切位点连接②举例例如pUC19质粒用EcoRⅠ和HidⅢ双酶切形成两个完全不同的粘性末端，目的DNA片段用相同的两种限制性内切酶切割产生两个不同的粘性末端，在适当的连接反应条件下，它们会相互连接形成重组质粒DNA。（一）粘性末端连接法2.不同限制酶切位点连接③优点粘性末端连接可抑制载体和目的DNA分子的自连，因而可大大提高连接的效率。更重要是不同限制性酶切位点的粘性末端连接可以控制目的DNA和载体DNA的连接方向。在相同限制酶切位点连接时，目的DNA片段正向和反向连接的几率是相同的,而在不同限制性酶切位点连接目的DNA和载体连接的方向是唯一的。这在构建可转录和表达载体是非常关键的。（二）平头末端连接一些内切酶切割产生平头末端,具有平头末端的酶切载体只能与平头末端的目的基因连接。T4DNA连接酶可催化相同...