第五章基因的分离与鉴定基因的分离与鉴定方法真核生物基因克隆的实例染色体自主复制顺序的分离与鉴定着丝粒DNA的分离与鉴定端粒DNA的分离与鉴定第一节基因的分离与鉴定方法一．获得基因的一般方法1.化学合成方法主要用于较小基因的合成，或需改变密码子的基因。2.半化学合成法mRNA→cDNA→加人工接头或合成一段DNA→与载体相连3.筛选法用于各种方法从基因组文库或cDNA文库中选择目的基因。二．基因的筛选方法1.遗传互补法1)原理当把一外源DNA片段引入一受体细胞后，如果受体细胞获得某种新的性状，那么此片段上携带着决定新性状的遗传基因。i.营养缺陷型受体细胞+外源DNA→转化细胞涂布在合成培养基上→原养型细胞生长ii.受体细胞（无某种表型）+外源DNA→转化细胞涂布在特殊培养基上→具有新性状细胞iii.虽然有些受体细胞也能产生某种酶活性，但当转入目的基因后，该细胞可过量产生此酶活性，这亦可用实例：基因组文库DNA→转化酿酒酵母细胞（leu2,Leu-）→转化细胞（leu2/LEU2，Leu+）→LEU2基因基因组文库DNA→转化E.coli（无纤维素酶活性）→转化细胞可在纤维素平板上形成水解圈→纤维素酶基因优点：简便，快速，可靠，是首选方法。获得的基因一定是完整基因。缺点：适用范围较窄。必备条件：外源基因不仅能在受体细胞表达，而且必须具备生物学活性。于基因筛选。如酿酒酵母的MFα基因就是如此筛选到的。2)分离步骤分离基因组文库重组DNA分子→转化适当宿主细胞→涂布在选择培养基上→随机挑选阳性克隆，分离重组DNA分子→再转化相同受体细胞→高频转化子→基因的进一步证实和鉴定重组DNA转化细胞SDS-PAGE→出现新蛋白质带原载体转化细胞(一)分别制备无细胞抽提物酶活测定→酶活性出现非转化细胞（二）免疫分析→与特定抗原反应鉴定工作包括：限制酶图谱，基因定位，Southern杂交,序列测定2．核酸杂交法1)原理利用核酸探针与待分离DNA的同源序列可进行杂交的特点分离目的基因（同源序列不是完全相同序列）优点：不需要基因表达必备条件：合适的核酸探针或有关资料，外源DNA能在宿主细胞中扩增2)核酸探针种类i.DNA探针:分离自某一种生物ii.寡核苷酸探针:根据目的基因编码蛋白质的部分氨基酸序列推测如：Leu-Val-Phe-His-Asp-Ala六肽QUN-GUN-UUQ-CAQ-GAQ-GCN对应mRNAN：ACGT/UCAN-AAP-GTP-CTP-CG探针序列Q：CT/UP：AG32种14聚体混合物，其中必有一种14聚体与待测DNA完全互补*选择的肽段中氨基酸的简并密码子应最少。**这种探针最好用于目的cDNA分离。若用于分离基因，要事先考虑到此探针序列横跨内含子序列的可能。***此种探针亦可根据其他来源相同基因的保守序列设计。iii.cDNA探针:利用特异性mRNA反转录而成，亦可用不同mRNA混合物反转录而成iv.PCR探针v.RNA探针:由T3或T7启动子和相应聚合酶转录其下游基因片段而得3)分离步骤基因(基因组或cDNA)文库→制备DNA样品膜→与标记探针杂交→杂交斑点（阳性克隆）→分离重组DNA分子→作斑点杂交阳性克隆Southern杂交以确认杂交结果→DNA进一步证实和鉴定：核酸序列分析，与蛋白质一级结构比较；分离插入片段进行基因表达，用免疫方法或其他方法检测表达产物3.免疫法1)原理外源DNA引人宿主细胞后表达出蛋白质，以此为抗原与相应的抗体发生免疫反应,然后利用二抗与一抗反应，用二抗偶联的酶反应筛选目的DNA优点：不依赖于基因表达产物的生物学活性,只要抗原决定序列能被正确表达。*外源DNA可以是一个完整编码区，也可能是一个外显子，这些序列可以插入E.coli表达型载体。必备条件：待分离基因的表达产物—蛋白质必须纯化和用于制备相应抗体。2)分离步骤基因文库→蛋白质样品膜制备→免疫法筛选→有色斑点（阳性克隆）→进一步证实：分离阳性克隆无细胞抽提物，作斑点印迹，western印迹免疫分析；分离重组DNA，检测插入片段大小，测序等。4.染色体巡查法(chromosomewalking)1)原理利用DNA探针筛选对应重组DNA，然后以插入片段两末端片段为探针选择对应重组DNA，此次筛选的DNA插入片段仅以一端为探针，继续和重复该过程，直至筛选到目的基因优点：可获得染色体中一段DNA的限制酶图谱，对基因组全序列测定十分有用缺点：工作量大，鉴定...
