第二章基因引物设计•引物•引物的重要性•引物设计的原则•引物与PCR•引物设计软件•如何使用PREMIER5.0•引物同源性分析一、引物（primers）5’5’3’3’目的序列二、引物的重要性在整个PCR体系中，引物占有十分重要的地位PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关三、引物设计原则1、引物长度一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR或者某些特殊的PCR时可能会使用较长的引物，但是最多不超过50nt过长会导致其延伸温度大于74度，不适合TaqDNA聚合酶进行反应也会影响扩增的特异性2、碱基分布的均衡性同一碱基连续出现不应超过5个GC含量一般为40%-60%------GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR特异性-------GC含量太高也易于引发非特异性扩增3、引物Tm值一般要求：55-65度计算------对于低于20nt的引物，可以根据4（G+C）+2（A+T）来粗略计算-------对于较长引物，则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有引物设计软件最常用的计算公式4、引物二级结构引物二聚体------尽可能避免两个引物之间3’端有较多碱基互补发夹结构-------尤其要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸5、引物3’端引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败6、引物5’端引物的5’端可以有与模板DNA不配对碱基因此5’可以引入一段非模板依赖序列加上限制性核酸内切酶位点序列修改某个碱基，引入该位点的点突变以作研究标记放射性或者非放射性物质（地高辛等）7、扩增区域的二级结构如果模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构，在选择引物时，应使引物设计区域避开DNA这些区域四、引物与PCR引物浓度：一般为0.1-0.5umol/L（公司合成以后，干粉状，先离心，按照说明上加入无菌水溶解）PCR程序中退火温度：一般采用引物Tm值低5度作为PCR退火温度五、引物设计软件最常用的软件是PrimerPremier网站设计软件手动设计NCBI网站设计引物手动设计引物六、引物同源性分析用BLASTn软件进行同源性比较尽可能选择与非目的基因同源性小的序列作为引物选择3’端与非目的基因不同源的序列作为引物选择两个引物3’端与同一非目的基因不同源的序列作为引物练习：以人类PIWIL2的mRNA序列为例，设计RT-PCR引物2对，产物大小为150-250bp综合练习：在NCBI网站上查找人类BRCA2基因的DNA序列和mRNA序列，并查找该基因序列多态性与乳腺癌、卵巢癌的关系相关论文，针对论文报道的多态性区域进行引物设计。Thanks！
