免疫细胞分离和保存技术意义临床上的各种类型的免疫缺陷、自身免疫病以及肿瘤等疾病均可出现淋巴细胞或淋巴亚群的数量和功能的变化。因此用体外方法对机体具有免疫反应的外周血淋巴细胞及其亚群的数目或比例以及它们所显示的功能的强弱进行检测，是判断机体细胞免疫水平的一种重要手段。这对于临床认识疾病、探讨其发病机制、观察病情变化、判断预后、考核疗效和防治疾病等方面均有重要意义。要求分离的淋巴细胞纯度高、产量多，而且不丧失活性，同时也要求分离技术简单、操作方便。细胞分离基本原理不同细胞密度不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同血液中红细胞与白细胞比例约为600~1000：1，两者的比重不同其沉降速度也不同，通常用两种方法加以分离。（直立静置RT30～60min，紧贴红细胞层上的白膜层）一、白细胞的分离1、自然沉降法外周血，抗凝，静置约一小时血液分为三层，上层为血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为WBC，轻轻吸取此层即可得到富含WBC悬液，低渗破坏RBC，洗涤即可。无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。2、聚合物加速沉淀法某些高分子聚合物（如明胶、右旋糖酐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮等）可使红细胞凝聚成串，加速红细胞沉降，使之更易与白细胞分离。本法的细胞获得率比自然沉降法高。二、外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell)主要指淋巴细胞和单核细胞，是免疫学实验中最常用的细胞群。密度为1.075~1.090。人的红细胞密度为1.093粒细胞密度为1.092单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090常用的分离剂为：Ficoll和Percoll分离剂1、Ficoll分层液主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法。其主要成分为聚蔗糖(商品名为Ficoll)其密度为1.020。可将血液分成四层，从上到下依次是：血浆、单个核细胞、粒细胞和红细胞。Ficoll成份：2份6%聚蔗糖（ficoll)水溶液+1份34%泛影葡胺（hypaque)生理盐水溶液。人外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells，PBMC）的分离聚蔗糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque)2、Percoll分层液是一种连续密度梯度离心分离法，其主要成分为：硅胶颗粒，其原液密度为：1.135。经过聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrolidone,PVP)处理的硅胶颗粒大小不一的混悬液。高速离心后，形成连续密度梯度（由下而上的逐减的连续密度梯度，densitygradient），可将密度不同的细胞分离纯化。可将血液分成四层，从上到下依次是：死亡细胞和血小板、单核细胞、淋巴细胞、粒细胞和红细胞。淋巴细胞纯度98%,单核细胞纯度78%。流程长,步骤繁,成本高。三、淋巴细胞的分离与纯化PBMC悬液富含淋巴细胞，但有混杂有单核细胞、红细胞和血小板。贴壁粘附法磁铁吸引法Percoll分离液法（去单核细胞）红细胞的去除:无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。血小板的去除:离心洗涤2~3次。1.贴壁粘附法2.利用二者具黏附玻璃、塑料和葡聚糖凝胶（SephhadexG-10)等特性。95%为淋巴细胞，活性大于95%。但损失部分B淋巴细胞。2.磁铁吸引法PBMC吞噬直径3um的羰基铁颗粒，用磁铁将细胞吸至管底，上清即含较纯的淋巴细胞。3.Percoll分离液法E花环沉降法EA花环沉降法尼龙毛柱分离法四、T细胞和B细胞的分离（一）E花环沉降法成熟T细胞表面有SRBC受体（E受体），可和SRBC形成E花环，B细胞则无。（二）EA花环B细胞表面带有IgGFc段受体，AgAb复合物中IgGFc段牢固结合；这类红细胞抗体致敏的动物红细胞（EA)黏附在B细胞周围形成花环。（三）尼龙毛柱分离法利用B细胞和单核细胞具有黏附在尼龙（nylonwool)表面的特性。先洗脱出的事T细胞，再用培养也便冲洗边捻压塑料管，流出来的液体中主要含B细胞。T细胞纯度达90%，B细胞纯度达80%。（一）亲和板结合分离（二）免疫磁珠分离（三）流式分选五、细胞亚群的分离T细胞：TCR、CD3、CD4、CD8、CD25等B细胞：BCR、CD19、CD5等NK细胞:TCR/CD3－、BCR/CD19－、CD56+、CD16+Macrophage:DC:Mastcells:……免疫细胞表面标志正选（positiveselection）法：纯化所需的细胞负选（negtiveselection...
