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测序技术介绍测序技术发展史一代测序1954年，Whitfeld等用化学降解法测定多聚核糖核苷酸序列，是关于DNA测序技术的较早报道。1977年，Sanger发明DNA双脱氧核苷酸末端终止测序法（chainterminatorsequencing），A.M.Maxam和W.Gilbert发明DNA化学降解测序法(chemicaldegradationsequencing)，2项技术的出现，标志第1代测序技术诞生。Sanger测序法的原理每一次DNA测序反应都由4个独立反应组成；由于DNA双链中核苷酸以3′，5′-磷酸二酯键相连，因此在测序过程中掺入2′，3′-双脱氧核苷三磷酸———ddNTP（不含3′-OH），当ddNTP位于DNA双链的延伸末端时，无羟基3′端不能与其他脱氧核苷酸形成3′，5′-磷酸二酯键，因此，DNA双链合成便终止；若在终止位点掺入ddATP，则新生链末端为A，若掺入ddTTP、ddCTP、ddGTP，相应地，新生链末端则是T、C或G。该测序技术的具体做法如下：将模板、引物、4种dNTP（其中含有一种为放射性同位素标记的核苷酸）与DNA聚合酶共同保温，形成的混合物包含许多长短不一的片段，最后利用聚丙烯酰胺变性凝胶电泳（SDS-PAGE）分离该混合物，得到放射性同位素自显影条带图谱，人们依据凝胶电泳图即可读出DNA双链的碱基序列组成。自动化测序实际上已成为当今dna序列分析的主流。美国PEABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等dna测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。测序过程中的常见问题分析在进行DNA测序时，紧接引物的10—30Bases有时不一定能完全读清楚。由于DNA结构上的原因，有时会出现反应中途无法进行之情况。如：G/Crich;G/CCluster；PolyA、PolyT的连续结构等。此外，另一种情况为反应中途出现的套峰现象，此种情况一般为DNA结构中的重复序列，造成测序用引物和模板之间有二个以上的结合位点。具体问题分析如下：1：测序结果有很多套峰，出现很多N值原因分析：PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。在序列的起始端出现N值，主要是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰，是机器无法正确判读出位何值。有时，引物二聚体或者起始端小片段的丢失，也会出现N值。模版本身含杂合序列，有等位基因。测序过程中的常见问题分析2：为什么找不到我的PCR引物序列？用PCR引物作为测序引物，所测序列是从引物3末端后第一个碱基开始的，所以就找不到您的测序引物了。可以进行反向测序，得到引物的反向互补序列。还可以将所测片段克隆到适当载体中，由于通用引物与插入序列有一段距离，就可以测出您的引物序列。3：测序结果和文献资料不一样，为什么?原因有很多，如同一种动物，在不同的种族之间，或者不同的个体之间，基因序列也不一定完全一样。如果是PCR产物克隆测序,那还有PCR过程中的错配因素等等。我们提供的测序结果是客户样品序列的忠实结果，不能保证和文献序列完全一致。4：过短的PCR产物为什么不适于直接测序？首先由于一般的PCR产物纯化试剂盒要求产物片段大于200bp,过短的PCR产物不能进行纯化；再者，测序的前50bp和后50bp的序列是不好的，所以不适于直接测序。测序过程中的常见问题分析5：酒精如果没有挥发完全,在约300bp处会出现连续异常的G峰，酒精挥发时间过长会导致DNA断裂。第一个峰，重叠干扰。如果不判读为干扰峰，那就说明样品不纯，如果是基因组DNA，就很好地说明了样品为杂合子，该位点可能存在SNP现象（T/G）。如果判读为干扰峰，我们只需认定样品此处碱基为T为行了。第二个峰，错位干扰。如果不判读为干扰峰，则说明样本可能比预期多一个碱基（G），如果判读为干扰峰，我们仍只需认定样品此处碱基为T为行了。测序过程中的常见问题分析6：为什么用PCR产物或质粒测序时，经常会出现套峰现象?下图是pGEM-T载体测序的结果，在83位点处测序结果出现双峰，即模板中含有两个或两个以上的相同载体，但是插入片段不同。解决办法：重新挑取单克隆或者重新提取质粒。需要注意的是，重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段，并不足以证明模板的单一。测序过程中的常见问题分析7：poly结构的测序结果以polyT为例，在polyA/T...