2水解酶及氧化还原酶组织化学

 水解酶及氧化还原酶组织化学  原理及方法  水解酶 hydrolases  指催化底物发生水解反应的酶类  例如:磷酸酶类、酯酶类等 AB＋H2O AH＋BOH  磷酸酶类  磷酸酶类是水解磷酸化合物的酶的总称  水解磷酸酯键，释放磷酸离子，为重金属捕获而产生沉淀；或释放萘酚而为重氮盐耦联 而显色。  碱性磷酸酶：在pH9.2-9.4 表现为最大活性  酸性磷酸酶：在pH5.0 显示最大活性  显示法： • 金属沉淀法 • 偶 氮耦联法  碱性磷酸酶 alkaline phosphatase ,AKP、ALP  在碱性范 围 ，催化各 种 醇 和 酚的磷酸酯水解。  磷酸和 R 能 用 组化方法捕获。 • 钙 钴 法：捕获磷酸 • 偶 氮耦联法：当 R 为萘酚衍 生物时 ，捕获R • 二 者 最终 均 形 成 有 色沉淀，可 作 定 位 观 察 。  激 活：金属离子—Mg2+ 、Mn 2+ 、Zn 2+ 、Co 2+  抑 制 ：Tetramisol(四 咪 唑 )、各 种 醇 类、L-半 胱 氨 酸  钙 钴 法（ 金属沉淀技 术 ） Gomori-Takamatus 法  原理：把 游 离的磷酸变 为盐的形 式 从 而产生沉淀 • β-甘 油 磷酸钠 （ 底物） ─ →磷酸离子 • 磷酸离子+Ca2+ ─ →磷酸钙 （ 不 可 见 ） • 磷酸钙 +Co2+ ─ → 磷酸钴 （ 不 可 见 ） • 磷酸钴 +S2- ─ →硫 化钴 （ 不 溶 ，可 见 ）  条件：pH9.4  作 用 液： • 2%巴比妥钠 • 3%β-甘 油 磷酸钠 • 2%无水氯化钙 • 2% MgSO4.7H2O  步骤： • 新鲜恒冷箱切片，8μ  不 固定 直接进作 用 液  FCa（ 氯化钙 Formalin） 固定 5'-2h，4℃，固定 后蒸馏水洗 • 作 用 液10-60’，37℃（ 视组织而定 ） • 流水5’ • 2%硝 酸 钴 5’ • 蒸 馏 水 洗 • 1-2%硫 化 铵 1’（ *硫 化 铵 需 新 鲜 配 制 ） • 蒸 馏 水 洗 • 甘 油 明 胶 封  结 果 ： 黑 色 的 颗 粒 状 沉 淀  对 照 ： • 去 底 物 （ 以 双 蒸 水 替 代 β-甘 油 磷 酸 钠 ）， 结 果 阴 性 • 进 作 用 液 前 用 抑 制 剂 抑 制 酶 或 将 切 片 置 沸 水 中 使 酶 失 活  注 意 ： 组 织 内 含 铁 血 黄 素 与 钙 盐 形 成 棕 黑 色 沉 淀...