蛋白质核酸沉淀分离的技术VIP免费

沉淀分离技术第三章沉淀和结晶的区别:形态成分纯度结晶:同类分子或离子以规则排列形式析出；沉淀:无序析出，纯度远低于结晶。操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些就是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。沉淀法就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，从而将溶液中的欲提取的成分和其它成分分开的技术。沉淀法操作步骤：①加入沉淀剂。②沉淀剂的陈化，促进粒子生长；③离心或过滤，收集沉淀物。加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。沉淀能否发生；沉淀剂或沉淀条件下对活性结构是否有破坏作用；沉淀剂是否容易除去；用于食品、医药产品的沉淀剂是否对人体有害。沉淀过程应考虑的问题：沉淀技术分离生化产物的典型例子是蛋白质的分离提取优点：设备简单、成本低、原材料易得、便于小批量生产；缺点：所得沉淀物可能聚集有多种物质，或含有大量的盐类，或包裹着溶剂，产品纯度常比结晶法低，过滤也较困难。eg.从血浆中通过5步沉淀生产纯度高达99%的免疫球蛋白和96%~99%的白蛋白。图1利用蛋白质沉淀大规模提纯白蛋白与免疫球蛋白的工艺流程图乙醇法沉淀沉淀物Ⅰ＋Ⅱ＋Ⅲ血浆乙醇法沉淀沉淀物Ⅱ乙醇法沉淀沉淀物Ⅴ上清液IgG(纯度99%)废弃沉淀重新溶解的沉淀白蛋白(纯度96～99％)重新溶解的沉淀废弃上清液乙醇法沉淀沉淀物Ⅰ＋Ⅲ乙醇法沉淀沉淀物Ⅳ废弃沉淀重新溶解的沉淀废弃上清液沉淀法分离蛋白质的特点：生产前期可使原料液体体积很快减小10~50倍，从而简化生产工艺、降低生产费用；使中间产物保持在一个中性温和的环境；可及早将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合液中分离出来，避免蛋白质的降解，提高产物稳定性；用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色谱分离使用的限制因素降低到最少。§3.2蛋白质的溶解特性蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。图2蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域蛋白质性质溶液性质分子大小溶剂可利用度（如：水）氨基酸组成pH值氨基酸序列离子强度可离子化的残基数温度极性/非极性残基比率极性/非极性残基分布氨基酸残基的化学性质蛋白质结构蛋白质电性化学键性质表1影响蛋白质溶解度的参数§3.3蛋白质胶体溶液的稳定性防止蛋白质凝聚沉淀的屏障：⑴蛋白质周围的水化层（hydrationshell)可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。⑵蛋白质分子间静电排斥作用。（存在双电层）因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度（ζ电位）降低蛋白质溶液的稳定性，实现蛋白质的沉淀。吸引力颗粒间的相互作用颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。VanderWaals力Keeson引力（偶极力）Debye引力（诱导力）London引力（色散力）是最重要的一种引力，因为所有分子都是可以被极化的，所以它是普遍存在的。其他沉淀法金属沉淀法聚电解质沉淀法非离子型聚合物沉淀法§3.4蛋白质沉淀方法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法中性盐盐析法①①成本低，不需要特别昂贵的设备成本低，不需要特别昂贵的设备②②操作简单、安全操作简单、安全③③对许多生物活性物质具有稳定作用对许多生物活性物质具有稳定作用一、中性盐沉淀法（盐析法）盐析：在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程。盐析：在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程。得到的样品欲继续纯化，需花一定时间脱盐。得到的样品欲继续纯化，需花一定时间脱盐。优点优点缺点缺点盐浓度Salting-in溶解度Salting-out蛋白质和酶均易溶于水，分子中的－COOH、－NH2和－OH等亲水基团，与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成亲水胶体亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和...