上一内容下一内容回主目录返回24/10/24蛋白质序列分析蛋白质序列分析上一内容下一内容回主目录返回24/10/24蛋白质一级结构即蛋白质多肽链中氨基酸排列顺序，既是研究蛋白质分子高级结构和功能的基础，又有助于蛋白质基因结构的研究。测定蛋白质氨基酸序列对诊断学新方法开发、治疗新方法建立及多肽类药物的研究均有重要意义。第一节肽和蛋白质测序策略上一内容下一内容回主目录返回24/10/24①根据基因测序结果，从cDNA演绎肽和蛋白质序列；简单、快捷，甚至可得到未分离出的蛋白质或多肽序列信息，但得到的一级结构不含蛋白质翻译后修饰及二硫键位置等信息；②直接测序策略；③质谱测序与生物信息学搜索相结合的策略。第一节肽和蛋白质测序策略上一内容下一内容回主目录返回24/10/241953年，FrederickSanger在对牛胰岛素研究中首先提出氨基酸直接测序概念；迄今为止，直接测序已阐明了几千种蛋白质的氨基酸序列。第二节氨基酸直接测序上一内容下一内容回主目录返回24/10/24确定不同的多肽链数目根据蛋白质N-端或C-端残基摩尔数和蛋白质相对分子质量可确定蛋白质分子中多肽链数目；单体蛋白质分子只含一条多肽链，蛋白质摩尔数与末端残基摩尔数相等；由多条多肽链组成的蛋白质分子，末端残基摩尔数是蛋白质摩尔数的倍数。第二节氨基酸直接测序上一内容下一内容回主目录返回24/10/24肽链的裂解当蛋白质分子由二条或二条以上多肽链构成时，必须裂解这些多肽链。如果多肽链是通过非共价相互作用缔合的寡聚蛋白，用8mol/L尿素、6mo1/L盐酸胍或高浓度盐等变性剂处理，裂解寡聚蛋白质中的亚基；如果多肽链之间通过共价二硫键交联，可采用氧化剂或还原剂断裂二硫键。再根据裂解后的单个多肽链不同大小或不同电荷进行分离、纯化。第二节氨基酸直接测序上一内容下一内容回主目录返回24/10/24多肽片段太长，不能直接进行序列测定，必须通过特定反应将裂解为更小的肽段；通过两种或几种不同断裂方法（断裂点不同）将每条多肽链样品降解成为两套或几套重叠肽段或肽碎片，每套肽段分别进行分离、纯化，再对纯化后的每一肽段进行氨基酸组成和末端残基分析。肽链的裂解第二节氨基酸直接测序上一内容下一内容回主目录返回24/10/24采用化学或酶反应裂解肽链中某些特殊位置上的肽键，产生若干能进行测序的小片段；一般将蛋白质样品分为两等份，采用不同试剂裂解产生两套不同片段，分别完成两套片段测序后，根据重叠情况即可重新排序。肽链的裂解第二节氨基酸直接测序上一内容下一内容回主目录返回24/10/24肽链的裂解-酶解法蛋白酶酶切位点内肽酶胰蛋白酶Rn-1=Arg,LysRn≠Pro胃蛋白酶Rn=Leu,Phe,Trp,Tyr,ValRn-1≠Pro糜蛋白酶Rn-1=Phe,Trp,TryRn≠Pro内肽酶GluCRn-1=Glu外肽酶亮氨酸氨肽酶R1≠Pro氨肽酶所有N-端残基羧肽酶ARn≠Arg,Lys,ProRn-1≠Pro羧肽酶BRn=Arg,LysRn-1≠Pro羧肽酶C所有C-端残基用于蛋白质部分裂解的蛋白酶第二节氨基酸直接测序上一内容下一内容回主目录返回24/10/24下一个残基不是Pro时，胰蛋白酶可裂解肽链羧基端（C端）带正电荷残基（Arg和Lys）；将胰蛋白酶消化所获得特征片段图谱与数据库进行比较，即可进行蛋白质的鉴定。肽链的裂解-酶解法第二节氨基酸直接测序脯、精、赖上一内容下一内容回主目录返回24/10/24除去裂解位点后，即除去Lys或Arg支链上正电荷，这个位点上的肽将不再被胰蛋白酶切断；肽链的裂解-酶解法第二节氨基酸直接测序赖、精上一内容下一内容回主目录返回24/10/24如果在其他氨基酸支链上引入正电荷，会产生一个可被胰蛋白酶识别的新裂解位点；肽链的裂解-酶解法第二节氨基酸直接测序上一内容下一内容回主目录返回24/10/24内肽酶专一性比胰蛋白酶略差，所产生肽片段小，与其它肽片段重叠程度不够，肽片段在蛋白质序列中重新排列时的位置可能发生错误；对Arg和Lys含量较高的蛋白质，则可采用限制胰蛋白酶水解方式，亦即通过改变反应条件，缩短反应时间，使酶与肽链接触机会减小，从而获得符合测序要求的肽片段。肽链的裂解-酶解法第二节氨基酸直接测...
