(转载)BAC 文库构建技巧 (2011-07-21 09:39:20) 基因组DNA 文库构建实验技巧 基因组DNA 文库有十分广泛的用途,如用于分析、分离特定的基因片段,用以基因表达调控、人类及动植物基因组工程的研究。通常情况下, 基因组文库构建的基本流程可以归为4 大步骤:分离基因组DNA、对基因组DNA 作相关的处理、将基因组DNA 片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞。 一、分离基因组DNA( gDNA) 毫无疑问,优质的基因组DNA 对于基因组文库构建是至关重要的。研究者需要查阅文献,通过经验来选择合适的基因组DNA 分离方法,在分离过程中保证DNA 不被过度剪切或降解,同时也要尽量保证DNA的纯度。 二、处理基因组DNA 根据研究目的,研究者需要选择合适的载体。不同的载体对基因组DNA 的长度有不同的要求,研究者必须选择合适长度的基因组DNA 来构建基因组文库。比如,对于黏粒载体(比如Epicntre 的 pCC1FOSTM、pEpiFOSTM-5、 pWEB-TNCTM、 pWEBTM) , 合适的片段长度大约为40kb;对于BAC 载体(比如Epicentre 的 pIndigoBAC-5、 pCC1BACTM),平均来说,合适的片段长度为120kb-300kb。 构建黏粒基因组DNA 文库,研究者需要将基因组DNA 用注射器抽打来随机剪切DNA;接着用末端修复酶修复DNA,可以提高DNA 连接入载体的效率;然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb 左右的DNA片段,随后使用Epicentre GELase 胶回收试剂盒回收DNA。 构建BAC 基因组DNA 文库,研究者需要将基因组DNA 用限制性内切酶(常用EcoR I、 BamH I 或者Hind III)来消化基因组DNA,然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA 片段(比如100kb-150kb),随后透析回收DNA。 需要注意: ( 1)电泳时,要选用合适的DNA Ladder,以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA。用Epicentre 试剂盒构建黏粒文库时,就可以直接采用文库试剂盒内的Control Insert DNA 来做marker ,既方便又准确。 ( 2)电泳以后,应该避免用紫外光照射目标DNA,紫外光照射DNA会显著降低克隆效率。解决方法:把marker 所在的部分凝胶切下,在紫外灯下做好记号, 然后以此为参考定位所需的片段。 ( 3)回收DNA 的时候,应该要避免过度离心,以防止DNA 被剪切,降低文库质量。 三、载体的选择 目前,常用的基因组文库载体有黏粒载体、P1 噬菌体载体、PAC 载体( P1 人工染色体)、BAC 载体(细菌人工染色体)和YAC 载体(酵母人工染色体...