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(转载)BAC 文库构建技巧 (2011-07-21 09:39:20) 基因组DNA 文库构建实验技巧 基因组DNA 文库有十分广泛的用途，如用于分析、分离特定的基因片段，用以基因表达调控、人类及动植物基因组工程的研究。通常情况下， 基因组文库构建的基本流程可以归为4 大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA 作相关的处理、将基因组DNA 片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞。 一、分离基因组DNA（ gDNA） 毫无疑问，优质的基因组DNA 对于基因组文库构建是至关重要的。研究者需要查阅文献，通过经验来选择合适的基因组DNA 分离方法，在分离过程中保证DNA 不被过度剪切或降解，同时也要尽量保证DNA的纯度。 二、处理基因组DNA 根据研究目的，研究者需要选择合适的载体。不同的载体对基因组DNA 的长度有不同的要求，研究者必须选择合适长度的基因组DNA 来构建基因组文库。比如，对于黏粒载体（比如Epicntre 的 pCC1FOSTM、pEpiFOSTM-5、 pWEB-TNCTM、 pWEBTM） ， 合适的片段长度大约为40kb；对于BAC 载体（比如Epicentre 的 pIndigoBAC-5、 pCC1BACTM），平均来说，合适的片段长度为120kb-300kb。 构建黏粒基因组DNA 文库，研究者需要将基因组DNA 用注射器抽打来随机剪切DNA；接着用末端修复酶修复DNA，可以提高DNA 连接入载体的效率；然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb 左右的DNA片段，随后使用Epicentre GELase 胶回收试剂盒回收DNA。 构建BAC 基因组DNA 文库，研究者需要将基因组DNA 用限制性内切酶（常用EcoR I、 BamH I 或者Hind III）来消化基因组DNA，然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA 片段（比如100kb-150kb），随后透析回收DNA。 需要注意： （ 1）电泳时，要选用合适的DNA Ladder，以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA。用Epicentre 试剂盒构建黏粒文库时，就可以直接采用文库试剂盒内的Control Insert DNA 来做marker ，既方便又准确。 （ 2）电泳以后，应该避免用紫外光照射目标DNA，紫外光照射DNA会显著降低克隆效率。解决方法：把marker 所在的部分凝胶切下，在紫外灯下做好记号， 然后以此为参考定位所需的片段。 （ 3）回收DNA 的时候，应该要避免过度离心，以防止DNA 被剪切，降低文库质量。 三、载体的选择 目前，常用的基因组文库载体有黏粒载体、P1 噬菌体载体、PAC 载体（ P1 人工染色体）、BAC 载体（细菌人工染色体）和YAC 载体（酵母人工染色体...