免 疫 沉 淀 ( Immunoprecipitation, IP) 原 理 IP 是 利 用 抗 原 蛋 白 质 和 抗 体 的 特 异 性 结 合 以 及 细 菌 蛋 白 质 的 “protein A/G"特 异 性 地结 合 到抗 体 (免疫球蛋 白 )的 FC 片段的 现象开发出来的 方法。目前多用 protein A/G 预先结 合 在 argarose beads 上,使之与含有抗 原 的 溶液及 抗 体 反应后,beads 上的 prorein A/G 就能达到吸附抗 原 的 目的 。通过低速离心,可以 从含有目的 抗 原 的 溶液中将目的 抗 原 与其它抗 原 分离。 免疫沉淀实验的 操作步骤比较多,同时由于在非变性 条件下进行实验,所以 要得到一个完美的 实验结果,不仅需要高质 量的 抗 体 ,同时对免疫沉淀体 系也需要有严格的 控制指标。免疫沉淀实验从:蛋 白 样品处理;抗 体 -agarose beads 孵育;抗 体 -agarose beads 复 基 本 实 验 步 骤 (1)收获 细 胞 ,加 入 适 量细 胞 IP 裂 解 缓 冲 液(含蛋 白 酶 抑 制剂 ),冰 上或 者 4℃ 裂 解 30min, 12,000g 离心 30 min 后取 上清 ; (2) 取 少 量裂 解 液以 备 Western blot 分析 ,剩 余 裂 解 液将 1μg 相 应的 抗 体 和 10-50 μl protein A/G-beads 加 入 到细 胞 裂 解 液,4°C 缓 慢 摇 晃 孵育过夜 ; (3)免疫沉淀反应后,在 4°C 以 3,000 g 速度 离心 5 min,将 protein A/G-beads 离心至 管 底 ;将上清 小 心吸去 ,protein A/G-beads 用 1ml 裂 解 缓 冲 液洗 3- 4 次 ;最 后加 入 15μl 的 2×SDS 加 样缓 冲 液,沸 水 煮 10 分钟 ; (4)SDS-PAGE, Western blotting 或 进行质 谱 分析 。 一 、样品处理 : 免疫沉淀实验成 功 与否 ,第 一步处理样品非常 关 键 。免疫沉淀实验本 质 上是 处于天 然 构 象状 态 的 抗 原和 抗 体 之间 的 反应,而 样品处理的 质 量决 定 了 抗 原 抗 体 反应中的 抗 原 的 质 量,浓 度 以 及 抗 原 是 否 处于天 然 构象状 态 。所以 制备 高质 量的 样品以 用 于后续 的 抗 体 -agarose beads 孵育对免疫沉淀实验是 否 成 功 非常 关键 。在这 个环 节 中,除 了 要控制所有操作尽 量在冰...