DNA的分离纯化及测定

第一章 D N A 的分离、纯化及测定 第一节 D N A 的提取 一、提取程序的原理 植物 DNA 的提取程序应包括以下几项； 1，破碎(或消化)细胞壁释放出细胞内容物。 然而许多操作在破壁的同时也会剪切 DNA，因此任何方法都是在 DNA 的完整性和产量这两个方面之间折衷考虑的结果。 分离总基因组 DNA 常用的破壁方法 是将植物组织胀水，然后研磨成细粉， 或者将新鲜植物组织在干冰或液氮中快速冷冻后，用研钵将其磨成粉。 分离核 DNA 或细胞器 DNA 时则应采取较为温和的破壁方法，以免过早破坏内膜系统，人们通常采用在含有渗透剂的缓冲液中 4oC 匀浆的方法来破壁。 2、破坏细胞膜使D N A 释放到提取缓冲液中。 这一步骤通常靠诸如SDS 或 CTAB 一类的去污剂来完成。去污剂还可以保护DNA 免受内源核酸酶的降解。通常提取缓冲液中还包含 EDTA，它可以螯合大多数核酸酶所需的辅助因子——镁离子。 3、去除 R N A 、蛋白质、多糖、丹宁和色素等杂质 一旦 DNA 释放出来，其剪切破坏的程度必须要降到最低。剧烈振荡或小孔快速抽吸都会打断溶液中高相对分子质量的 DNA 。一般说来，如果操作得当，可以得到相对分子质量长度为 50—l00kb 的 DNA。 在 DNA 粗提物中往往含有大量 RNA、蛋白质、多糖、丹宁和色素等杂质，这些杂质有时很难从 DNA 中除去。大多数蛋白可通过氯仿或苯酚处理后变性、沉淀除去，绝大部分RNA 则可通过经处理过的 RNase A 除去。但多糖类杂质一般较难去除，这些杂质浓度高时，常常使DNA 提取物呈胶状，更为重要的是即使是低浓度情况下它们也会干扰后续操作，如抑制某些 DNA 修饰酶包括限制性内切酶的活性，从而阻碍 Southern 杂交或基因克隆；同时多糖杂质还会影响分光光度法对核酸的定量分析等。 （植物分子生物学----实验手册 （英） Clarke M. S. 主编 顾红雅 瞿礼嘉 主译 高等教育出版社 1998 ） 二、基因组 D N A 的提取 1、基因组 D N A 用途 DNA 是遗传信息的载体，是重要的生物信息分子, 是分子生物学研究的主要对象。 为了进行测序, Southern 杂交|, 基因文库的构建，PCR 扩增等，高分子量和高纯度的基因组 DNA 是非常重要的前提. 2、基因组 DNA 提取的原则 保证提取的 DNA 具有一定的长度 纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质,多糖,脂类等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污...