DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定

DNA 的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定 分子实验报告 1 山东大学实验报告 2013 年 10 月 22 日至11 月 19 日 姓名 系年级 2011 级生技一班 学 号 201100140112 组别 四 题目DNA 的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定 同组者 一、【实验目的】 1.学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理。 2.掌握对DNA 进行限制性内切酶酶切的实验技术。 3.学习和掌握DNA 连接酶的作用原理以及利用T4DNA 连接酶构建重组DNA 分子的实验技术。 4.学习和掌握利用CaCl2制备E.coli 感受态细胞的原理与方法。 5.学习和掌握热激法转化E.coli 感受态细胞的原理与方法。 6.掌握α -互补筛选法的原理。 7.学习用试剂盒提取质粒DNA 的方法。 8.复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法。 9.学习和掌握利用琼脂糖凝胶电泳筛选重组质粒。 二、【实验原理】 通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶叫做核酸酶，其中特异水解断裂RNA分子的酶被称为核糖核酸酶，而特异性水解断裂DNA分子的酶被称为脱氧核糖核酸酶。核酸酶按其水解断裂核酸分子的不同方式，分为两种类型，一种是从核酸分子的末端开始，一个一个核苷酸地消化降解多核苷酸链，叫做核酸外切酶。另一种是从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫做核酸内切酶。 重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。 1．限制性核酸内切酶 （ 1） 限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。 根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解，Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点 1000bp；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解，Ⅱ型限制酶的切割位点一般 DNA 的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定 分子实验报告 2 在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。。 III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24— 26bp。...