总RNA的Trizol法提取流程及原理

总 RNA 的 Trizol 法提取流程及原理提取原理 Trizol 试剂的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是对细胞进行裂解,从而使细胞当中的蛋白质以及核酸物质解聚而得以释放。苯酚虽然可以有效的使蛋白质变性，但它不能完全抑制 RNA 酶的活性，因此 Trizol 中还加入了 8—羟基喹啉、异硫氰酸胍、B-巯基乙醇等来抑制内源和外源 RNase（即 RNA 酶）。Trizol 试剂是直接从细胞或组织中提取总 RNA 的试剂。在样品的裂解液或匀浆中，Trizol 能保持 RNA 的完整性。加入氯仿（CHCl3）后离心，样品能分成水样层和有机层。而 RNA 存在于水样层中。在收集上面的水样层后，RNA 可以通过异丙醇沉淀的方法来还原。在除去水样层之后，样品中的核酸和蛋白也能相继以沉淀的形式还原。乙醇沉淀能析出中间层的 DNA，在有机层中加入异丙醇能析出有机层的蛋白。Trizol 试剂不但可用于小量样品（组织：50-100mg；细胞：5X106），也可用于大量样品（组织三 lg 或细胞±107），对动物、植物、细菌、血液提取都适用，可同时处理大量不同样品。反应迅速，提取的总 RNA 没有 DNA 和蛋白质污染，可用于 Northernblot、RT-PCR、RNase 保护分析等。本试剂带有颜色，以便于区分水相和有机相，同时最大限度的保持 RNA 的完整性。保存条件：2-8°C，避光保存 12 个月。实验前需要准备的试剂：Trizol，氯仿，异丙醇，75%乙醇（用 RNase-Free 水配制），RNase-Free 水。实验前需要准备的物品：1ml 注射器，1.5ml 已卩管（DEPC 处理过），大、中、小号枪头（DEPC 处理）样品前处理注意点：1.选择新鲜血液。2.选择生长旺盛的组织。3.选择新鲜的幼嫩组织。4.选择处于生长旺盛的时期的细胞。RNA 纯化要求：1.纯化后不应存在对酶（如逆转录酶）有抑制作用的物质。2. 排除有机溶剂和金属离子的污染。3.蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降到最低程度。4•排除 DNA 分子的污染。RNA 提取的注意事项：1.杜绝外源酶的污染。（1）严格戴好口罩，手套。（2）实验涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。（3）实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。2. 阻止内源酶的活性。（1）选择合适的匀浆方法。2）选择合适的裂解液。（3）控制好样品的起始量。3.明确自己的提取目的。（1）任何裂解液体系在接近样品最大起始量时，提取成功率急剧下降。（2）RNA 提取成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率...