原位杂交实验原理与方法 一、目的 本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。 二、原理 原位杂交组化（简称原位杂交，in situ hybridization histochemistry；ISHH）属于分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。 当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。 探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。目前，大多数放射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA 中，常用的同位素标记物有 3H、35S、125I 和 32P。同位素标记物虽然有灵敏性高，背底较为清晰等 优点，但 是由 于放射性同位素对 人 和环 境 均 会造 成伤 害 ，近 来有被 非同位素取 代 的趋 势 。非同位素标记物中目前最 常用的有生 物素、地 高辛 和荧 光 素三 种。 探针的种类按核酸性质不同又 可分为DNA 探针、cDNA 探针、cRNA 探针和合成寡 核苷 酸探针。cDNA 探针又 可分为双链 cDNA 探针和单链 cDNA 探针。 原位杂交又 可分为菌 落 原位杂交和组织原位杂交。 菌 落 原位杂交（Colony in situ hybridization） 菌 落 原位杂交是将细菌 从 培 养 平 板 转移 到硝 酸纤 维 素滤 膜 上，然后 将滤 膜 上的菌 落 裂 菌 以释 出 DNA。将 NDA 烘 干 固 定于膜 上与32P标记的探针杂交，放射自 显影 检测菌 落 杂交信 号 ，并与平 板 上的菌 落 对 位。 组织原位杂交（Tissue in situ hybridization） 组织原位杂交简称原位杂交，指 组织或 细胞的原位杂交，它 与菌 落 的原位杂交不同。菌 落 原位杂交需 裂 解细菌 释 出 DNA，然后 进行 杂交。而原位杂交是经 适 当处 理后 ，使细胞通透 性增 加 ，让 探针进 入细胞内与DNA 或 RNA杂交。 （一）探针的选 择 根 据 不同的杂交实验要求，应选 择 不同的核酸探针。在大多数情...
