原核表达及纯化总结

His 标签重组蛋白大量表达及纯化 一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化DH5α 鉴定 表达载体和目的片段的连接一般为10µL 连接体系，此步转化方法如下： 取100µL DH5α 感受态细胞，加入到10µL 连接产物体系中 ↓ 冰上放置30min ↓ 42℃准确热激 90 秒 ↓ 冰上放置3min ↓ 加入300µL 无 Amp+ 的LB 培养基，37℃ 100rpm/min 振荡培养 1h ↓ 将400μL 菌液全部涂 LB 平板（含 Amp+）水平放置30 min 待菌液完全吸收后， 在 37℃温箱中倒置培养过夜（12~16 h），直至出现单菌落。 2 阳性克隆的PCR 鉴定方法如下 挑取单菌落于 200μL 含 Amp+LB 培养基中（用 2.0 的离心管），摇床 200rpm/min，37℃培养 4h，待菌液浑浊后，取1μL 做菌液 PCR 鉴定。 PCR 扩增体系如下： 取1 μL 菌液作为模板 反应体系如下： 模板 1 µL 10×PCR 反应缓冲液（含 Mg2+ ） 2 µL dNTP(2.5 mmol/L/each) 1.6 µL 上游引物（10 µmol/L） 1 µL 下游引物（10 µmol/L） 1 µL Taq 酶（5 U/µL） 0.3 µL ddH2O 13.1µL Total 20 µL 条件： 94℃预变性 10min 94℃变性 45s 50℃退火 45s 72℃延伸 1min，30 个循环的扩增反应 72℃延伸 10 min 4℃ ∞ 1% 琼脂糖凝胶电泳检测： 电泳上样时：Marker DL2000 上样 3µ L 样品（1µ L loadingbu ffer +6µ L PCR 产物混匀上样） 100V，20min；紫外透射仪检测，出现目的带的对应菌落为阳性克隆。 （注意：记得保存菌种） 3 阳性克隆质粒抽提 取阳性克隆菌液 200µ L，加 3ml 含 Amp+ LB 液体培养基，37℃ 200rpm/min 培养 3-4h，待菌液浑浊后，进行质粒抽提。 质粒抽提方法如下： 取 1.5mL 菌液于 1.5mL 离心管中 ↓ 12000rpm 离心 30s，弃上清 ↓ 加 800μL STE 悬浮沉淀 ↓ 12000rpm 离心 30s，弃上清 ↓ 重复 STE 漂洗沉淀的过程 ↓ 加入 100μL 预冷的 solu tion Ⅰ，强烈振荡混匀 ↓ 温和加入 200μL solu tion Ⅱ（solu tion Ⅱ现用现配），盖紧管口快速颠倒 5 次， 放置冰上 2 min 至溶液清亮而粘稠 ↓ 极温和加入 150μL 预冷的 solu tion Ⅲ， 倒置温和振荡 10s，冰上放置 5 min ↓ 12000rpm 离心 5 min ↓ 取上清（400μL），加入等量的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡混匀 ↓ 12000rpm 离心 ...