变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)

实验四 变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE） 一、实验原理 变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是 Lerman 等人于 20 世纪 80 年代初期发明的，起初主要用来检测 DNA 片段中的点突变 (20, 42, 52, 53) 。Muyzer 等人在 1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究 (50) 。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE） (49) 。此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一 (49, 51)。 1 ．原理 双链 DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的 DNA 片段能够被区分开，但同样长度的 DNA 片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。DGGE/TGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度或是温度梯度，从而能够把同样长度但序列不同的 DNA 片段区分开来。 一个特定的 DNA 片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域(melting domain, MD)和解链行为(melting behavior) (20, 42)。一个几百个碱基对的DNA 片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成（图 1）。当温度逐渐升高（或是变性剂浓度逐渐增加）达到其最低的解链区域温度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。当温度再升高依次达到各其他解链区域温度时，这些区域也依次发生解链。直到温度达到最高的解链区域温度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链 DNA 完全解链。（图 1 显示的是一个 234bp 长的 DNA 片段的解链区域，横坐标是该 DNA 片段的序列，依次从第一个碱基到第 234 个碱基；纵坐标是解链温度。该 DNA 片段共有 3 个解链区域。MD1 是解链温度最低的一个解链区域，MD3 是温度最高的一个解链区域。） MD1MD2MD3图1：DNA片段解链区域示意图 不同的双链DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。当它们进行 DGGE/TGGE 时，一开始温度（或变性剂浓度）比较小，不能使双链DNA 片段最低的解链区域解链，此时 DNA 片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。然而一旦 DNA 片段迁移到一特定位置，其温度（或变性剂浓度）刚好能使双链DNA 片段最低的解链区域解链时，双...