1 / 6 微滴式数字PCR 操作程序 操作方法 1. 先打开电脑，再打开QX200 Droplet Reader 电源，在使用前需预热至少30 分钟； 2. 配制探针法定量反应体系，振荡混匀，离心除气泡，注意20ul 体系中所加样本核酸含量不要超过规定检测范围(1~100000 拷贝片段化核酸或者1~20000 拷贝较完整基因组DNA)，如完整的人类基因组DNA 不要超过66ng/20ul，可提前用限制性内切酶处理样本可提高检测浓度； 3. 将一个新的DG8 cartridge 放入 holder 中，注意缺口方向； 4. 将20ul 样品反应体系加入到 DG8 cartridge 中间一排的8 个孔内，不足 8 个样品时用20ul 1 2 / 6 ×bu ffer control 补足，建议使用Rainin 的8 通道20u l 排枪和20u l 枪头（不能用200u l 枪头），加样时枪头接近孔一侧底部，与侧壁呈大约15°角，缓慢打出液体，打出一部分后慢慢提升枪头位置再打出余下液体，不要将枪按至超过第一档位置以免引入气泡； 5. 在 DG8 cartridge 最底下一排8 个孔中各加入 70u l 微滴生成油（DG Oil），同样不能有空着的孔； 6. 盖上胶垫（gasket），注意两边的小孔都要钩牢； 3 / 6 7. 将以上holder 轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴，注意仪器上指示灯状态，一般2 分钟之内完成； 8. 微滴生成于cartridge 最上面一排孔内，建议使用Rainin 的8 通道P‐50 排枪和200ul 枪头小心缓慢吸取，调整吸取体积为40ul，将holder 放平，枪头以与孔壁呈30~45°角放入，轻触孔底，约 5 秒吸取40ul，再同样缓慢地打入 96 孔板相应位置孔内（约 5 秒），枪头贴近孔壁接近孔底，注意封上盖以防油挥发，每次弃去已使用过的cartridge 和胶垫； 4 / 6 9. 转移油滴进入96 孔板内完成后，用预热好的PX1 热封仪对其进行封膜（膜亮面朝上，暗面向下），推荐的运行程序为：180℃，10s，无需颠倒方向二次封膜； 10. 封好膜之后应该在 30 分钟内进行PCR 反应，或者放于 4℃冰箱 4 小时之内进行PCR，可在任意一台 96 孔PCR 仪上完成，注意升降温速度≤2.5℃/s。推荐反应条件： 1. 95℃，10min； 2. 94℃，30s 40 循环 Tm(退火温度按优化摸索得来的条件设置 )，60s； 3. 98℃，10min； 11. 查看微滴读取仪上状态指示灯指示是否正常(不同说明书上稍有不同)； 5 / 6 12. 将之前完成PCR 的96 孔板放入plate holder 中组装好，注意板斜角方位，如下图所示： 6...
