感受态细胞的制备及转化VIP专享

感受态细胞的制备 一、 实验原理 受体细胞通过一些特殊方法（如电击法，CaCl2，MnCl2，MgCl2等化学试剂法)的处理后，使细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的状态，成为感受态细胞。 本方案介绍的方法为 TSS 法和 KCM 转化法。 二、 材料及准备工作 一）材料准备 试剂、耗材名称 品牌 货号 蛋白胨 酵母提取物 氯化钠 琼脂粉 聚乙二醇（PEG8000） DMSO MgCl2 KCl CaCl2 氨苄青霉素 摇菌管 平皿（10cm） 500ml 锥形烧瓶 枪头（1ml，0.2ml） 0.22μm 过滤器 50ml 注射器 二)试剂配制 1、液体LB 培养基（200ml，高压灭菌，4℃保存备用） 蛋白胨 2.0g 酵母提取物 1.0g 氯化钠（NaCl） 2.0g 2、固体LB 培养基（2×100ml，高压灭菌） 蛋白胨 2×1.0g 酵母提取物 2×0.5g 氯化钠（NaCl） 2×1.0g 琼脂粉 2×1.5g 温度降低到 45℃后（不烫手），取其中一瓶加入氨苄至终浓度100μg/ml（100mlLB 加 100μl 100mg/ml 的氨苄）后铺平皿，另一瓶直接铺平皿。4℃保存备用。 3、TSS 液（100ml）（有效期 2 周） 聚乙二醇（PEG8000） 10g 终浓度 10% DMSO 5ml 终浓度 5% MgCl2(1mol/L） 5ml 终浓度50mmol/L LB 85ml 终浓度85% 去离子水补足100ml，0.22μm 过滤器过滤后，4℃保存备用 注：聚乙二醇分子量可以为 3000-8000 4、5×KCM 液（10ml）（可-20℃长期保存备用） KCl（2mol/L） 2.5ml CaCl2(1mol/L) 1.5ml MgCl2(1mol/L) 2.5ml 水补足到 10ml, 0.22μm 过滤器过滤后，4℃保存备用（不要高压消毒） 5、氨苄青霉素（amp）（100mg/ml） 取 0.5g 氨苄青霉素，溶解于 5ml 去离子水中，0.5ml 分装，-20℃保存备用 三）仪器设备 1、低温大容量离心机 2、恒温水浴锅 3、超净台 4、高压锅 5、37℃孵育箱 6、恒温摇床 7、制冰机 8、分光光度计 9、微量移液枪 10、低温冰箱 三、 步骤及注意事项 一）感受态制备（TSS 法） 1、取菌种，划LB 平皿板（无氨苄）； 2、挑取分离良好的独立克隆，接种到5ml LB 中，220rpm ，37℃恒温摇床孵育过夜； 3、取1 ml 摇好的菌液，接种到100 ml LB 中（500ml 锥形烧瓶），220rpm ，37℃孵育 2.5-3.0h，菌液OD600 达到0.2-0.5（0.36 效果较好，不要超过 0.6）； 4、取出菌液，冰浴 20min；然后 4℃，3000 rpm 离心 5 min ，收集细菌； 5、用 10 ml 冰浴...