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感受态细胞的制备、质粒DNA的转化和提取

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感受态细胞的制备 —LB 液体培养基:胰蛋白胨,1%(W/V);酵母提取物,0.5%(W/V);NaCl,1%(W/V),用固体NaOH 调节pH 为7.0~7.2,分装于三角瓶中,灭菌后存于室温。摇动三角瓶,如果发现变浑浊,表明已染菌,应弃掉重新配制; —0.1 mol/L CaCl2:称取1.47 g CaCl2•2H20(Amresco 分装)溶于100 mL 去离子水中,灭菌后存于4℃; —离心管(50 mL 或 80 mL 或 100 mL),灭菌; —培养试管,灭菌; —1 mL 枪头,灭菌; —1 mL 加样枪; —滤纸,用牛皮纸包好后灭菌; —10 mL 量筒,灭菌; —5 mL 移液管,用棉花塞入管口,卷于报纸中灭菌; —冰,离心管架; —恒温摇床,可见分光光度计,玻璃比色杯。 1.接种空白大肠杆菌于3 mL LB 培养基中,37℃剧烈震荡培养过夜; 2.将已培养好的种子液转入 100 mL LB 培养基中扩大培养至 OD650=0.3 后,将培养好的细菌置于冰上冷却 10 min; 3.4℃,4 000 rpm 离心 10 min 收集细菌,倒出上清,将离心管倒置于一干净滤纸上,将培养基控干; 4.用40 mL 冰预冷的 CaCl2 悬浮细菌,用加样枪冲吸,使菌体尽可能分散。冰上放置 30 min; 5.4℃,4 000 rpm 离心 10 min 收集细菌,倒出上清,再用4 mL 冰预冷的 CaCl2悬浮细菌,这些细菌可以立即使用,或者于4℃放置 12~ 24 h 以增加其敏感性后使用。 6.如果证明所制备的感受态细胞可用,可以在冰上分装为100 μ L 每管,再加入100 μ L 甘油(注意:甘油非常黏稠,吸取时应该多一点。),于液氮或-70℃冰箱中存放。存于低温下的感受态细胞,一定不能融解。如果已经融解,应丢弃,而不能再冻结保存而继续使用。 注意事项: 1.本实验室所用空白大肠杆菌菌株为JM109。空白菌可以于平板上划线后,用Parafilm 包好后存于4℃,也可将液体培养物存于4℃。但如果要长期保存,则应将细菌保存于50%的甘油中,存于-20℃或-70℃。当接种的细菌是来自于-20℃或-70℃存放的液体培养物时,接种应迅速,不等解冻,立即从表面刮下一块冰后,将菌种迅速放回低温存放; 2.一般于3 mL LB 培养基中过夜培养 12 h 后,菌体已很浓,可以进行扩大培养。于100 mL 培养基中培养 2~ 3 h 后,即可达到对数生长期。但有时如果由于存放过久,或者已经过数次解冻,造成细菌生活力下降,则倍增时间会延长; 3.对 OD 值的监测,当肉眼看到菌体已很浓时,于超净台上取 3 mL...

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