流式细胞仪的原理与使用知识点梳理汇总VIP免费

流式细胞仪的原理与使用一、定义流式细胞仪（flowcytometer）：是集光电子物理、光电测量、计算机、细胞荧光化学、单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。流式细胞术（flowcytometry,FCM）：是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识及技术。二、基本结构1.流动室和液流系统流动室由样品管、鞘液管、喷嘴等组成，由透明稳定的材料（化学玻璃、石英等）制成，是液流系统的核心部分。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力下从样品管射出。鞘液由鞘液管由四周流向喷孔，包围在样品外周后由喷嘴射出。2.激光源和光学系统光源根据被激发物质的激发光谱而定，常用弧光灯和激光。常用的弧光灯为汞灯，激光器多为氩离子激光器、氪离子激光器或染料激光器。经过特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发荧光供收集检测。3.光电管和检测系统荧光染色或荧光标记后的细胞受到合适的光激发后产生的荧光通过光电转换器转变为电信号进行测量。通常使用光电倍增管（PMT）。PMT响应时间短，为ns数量级，具有较强光谱响应特性，200～900nm光谱区内光量子产额较高，其增益从103到108可连续调节，有利于弱光的测量。由PMT输出的电信号放大后输入分析仪器。流式细胞仪中一般备有两类放大器。一类为线性放大器，即输出信号辐度与输入信号成线性关系，适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例如DNA测量。另一类是对数放大器，输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。免疫分析时需要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群，其荧光强度相差1～2个数量级；在多色免疫荧光测量中，用对数放大器采集数据易于解释。此外还有调节便利、细胞群体分布形状不易受外界工作条件影响等优点。4.计算机和分析系统放大后的电信号被送往计算机分析器。多道的道数与电信号脉冲高度相对应，与光信号强弱相关。对应道数年纵坐标通常代表发出该信号的细胞相对数目。多道分析器出来的信号经模-数转换器输往微机处理器编成数据文件，存储于计算机或仪器内可供调用。计算机可存贮同一细胞的6～8个参数。存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现，进行数据处理和分析，得出最终结果。三、工作原理1.参数测量原理流式细胞仪可以在测量区内同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。测量区即是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射会向立体角为2π的整个空间散射光线，散射光的波长和入射光的波长相同。由于一些生物学参数与细胞对光线的反射、折射等光学特性有关，因此散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关。未遭受任何损坏的细胞对光线具有特征性的散射，因此可以利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变，其散射光信号不同于活细胞。散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关，还与散射角、及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。2.样品分选原理流式细胞仪的分选功能由细胞分选器完成。由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，之后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中，其它液体被当作废液抽吸掉。某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选。稳定的小液滴由流动室上压电晶体在几十KHz的电信号作用下发生振动而迫使液流均匀断裂形成。液滴间距约距约数百μm。实验经验公式f=v/4.5d给出形成稳定水滴的振荡信号频率（v:液流速度，d:喷孔直径）。使用不同孔径的喷孔及改变液流速度，可以改变分选效果。充电电路和偏转板共同完成分选的含细胞液滴在静电场中的偏转。充电电压多为+150V，或-150V；偏转板间的电位差为数千伏。充电电路中的充电脉冲发生器由逻辑电路控制，因此从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段...