染色质免疫沉淀（ChIP）实验指南及技术总结 ChIP 是一项比较流行的研究转录因子（ transcription factor, TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。由于 ChIP 采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内 TF 与 Promoter 的结合情况。这个优势是 EMSA 这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或 RNA）之间会产生共价键。细胞内，当 TF 与 Promoter 相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。 一般 ChIP 的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA 复合物相互结合——加入 Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA 复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA 复合物——解交联，纯化富集的 DNA-片断——PCR 分析。 在 PCR 分析这一块，比较传统的做法是半定量－PCR。但是现在随着荧光定量PCR 的普及，大家也越来越倾向于 Q－PCR 了。此外还有一些由 ChIP 衍生出来的方法。例如RIP（其实就是用 ChIP 的方法研究细胞内蛋白与 RNA 的相互结合，具体方法和ChIP 差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA 逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是 ChIP 富集得到的 DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在 ChIP 的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。 第一天： （一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。 1、取出1 平皿细胞（10cm 平皿），加入 243u l 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。（培养基共有9ml） 2、37 摄氏度孵育10min。 3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。 450u l 2.5M 甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min 即可。 4、吸尽培养基，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 次。 5、细胞刮刀收集细胞于 15ml 离心管中（PBS 依次为5ml，3ml 和3ml）。预冷后2000rpm 5min 收集细胞。 6、倒去上清。按照细胞量，加入 SDS Ly sis Bu ffer。使得细胞终浓度为每200u l 含2×106 个细胞。这样每100u l 溶液含1×106 个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。 假设 MCF7 长满板为5×106 个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106 个...
