水稻转基因实验操作 （谢越、赵建宁、艾鹏慧、孙淑斌整理） （2 0 0 6 .7 ） 一、水稻（日本晴）愈伤组织的诱导（以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织） 1．消毒： 取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒： 1）将种子放入100ml 无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒1 分钟； 2）倒去酒精，加入100ml 30%次氯酸钠（NaClO）溶液（5.2%次氯酸钠），浸泡30 分钟； 3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5 遍，最后一遍浸泡30 分钟。 2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作） 1）种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿12－14 颗； 2）操作完毕用封口膜（Micropore TM Su rgical Tape）封好培养皿，在30℃光照培养箱，培养4 周； 3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），在30℃光照培养箱，继代培养1-2 周。(没有脱落的可在原培养基上继续培养7 天，次数多了效果会减弱) 二、农杆菌（工程菌）培养 挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌（EHA105）菌液100µl 于4ml YEP（含50mg/LSpec 和 50mg/L Str）培养液中，28℃，250rpm 振 荡 培养20-36h 至 菌液OD600 为0.8-1.0。 三 、 感 菌与共 培养 1） 取培养好的工程菌液1ml 于1.5ml 离 心 管 中，4℃，5000rmp，离 心 1min，去上清。用含 200µmol/LAs 的30ml AAM 感 菌液制 成悬 浮 液。 2）将长 到 一定 大 小 的水稻愈伤组织挑出 ，放入农杆菌悬 浮 液侵 染 5 分钟（愈伤量 没过50ml 离 心 管 锥 形 部 位 即 可）。 3）将愈伤组织取出 ，置于无菌的滤纸上沥 干30-40 分钟； 4）将愈伤组织置于共 培养基上(共 培养基上面 垫 上一层 9cm 无菌滤纸)。28℃（组培室 ）暗 培养2.5 天。 四 、愈伤组织的抗 生 素 筛 选 将愈伤组织取出 ，用无菌水清洗6 次，其 间 需不 停 的振 荡 （组培室 震 荡 机最大 速 率 ）。再 用含 500mg/L 羧 苄 青 霉 素 （Car）的无菌水浸泡30min-1h。最后置于无菌滤纸上沥 干2h。 1）第 一轮 筛 选：将沥 干的愈伤转入含 250mg/L 羧 苄 青 霉 素 （Car）和 50mg/L 潮 霉 素 的选择 培养基上进 行 第 一轮 选择 ，光照培养箱（30℃，24h 光照）中培养14 天。 2）将获 得 的抗 性愈伤转到 含 250mg/L...
