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水稻转基因实验操作

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水稻转基因实验操作 (谢越、赵建宁、艾鹏慧、孙淑斌整理) (2 0 0 6 .7 ) 一、水稻(日本晴)愈伤组织的诱导(以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织) 1.消毒: 取水稻成熟种子,人工或者机械脱壳,挑选饱满光洁无菌斑的种子,按以下步骤消毒: 1)将种子放入100ml 无菌烧杯中,倒入70%酒精消毒1 分钟; 2)倒去酒精,加入100ml 30%次氯酸钠(NaClO)溶液(5.2%次氯酸钠),浸泡30 分钟; 3) 倒去次氯酸钠溶液,用无菌蒸馏水清洗种子4-5 遍,最后一遍浸泡30 分钟。 2.诱导与继代培养:(以下步骤需无菌操作) 1)种子放在无菌滤纸上吸干,置成熟胚于诱导培养基中,每皿12-14 颗; 2)操作完毕用封口膜(Micropore TM Su rgical Tape)封好培养皿,在30℃光照培养箱,培养4 周; 3)在超净工作台上打开培养皿,用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织(淡黄色,致密呈球状),在30℃光照培养箱,继代培养1-2 周。(没有脱落的可在原培养基上继续培养7 天,次数多了效果会减弱) 二、农杆菌(工程菌)培养 挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌(EHA105)菌液100µl 于4ml YEP(含50mg/LSpec 和 50mg/L Str)培养液中,28℃,250rpm 振 荡 培养20-36h 至 菌液OD600 为0.8-1.0。 三 、 感 菌与共 培养 1) 取培养好的工程菌液1ml 于1.5ml 离 心 管 中,4℃,5000rmp,离 心 1min,去上清。用含 200µmol/LAs 的30ml AAM 感 菌液制 成悬 浮 液。 2)将长 到 一定 大 小 的水稻愈伤组织挑出 ,放入农杆菌悬 浮 液侵 染 5 分钟(愈伤量 没过50ml 离 心 管 锥 形 部 位 即 可)。 3)将愈伤组织取出 ,置于无菌的滤纸上沥 干30-40 分钟; 4)将愈伤组织置于共 培养基上(共 培养基上面 垫 上一层 9cm 无菌滤纸)。28℃(组培室 )暗 培养2.5 天。 四 、愈伤组织的抗 生 素 筛 选 将愈伤组织取出 ,用无菌水清洗6 次,其 间 需不 停 的振 荡 (组培室 震 荡 机最大 速 率 )。再 用含 500mg/L 羧 苄 青 霉 素 (Car)的无菌水浸泡30min-1h。最后置于无菌滤纸上沥 干2h。 1)第 一轮 筛 选:将沥 干的愈伤转入含 250mg/L 羧 苄 青 霉 素 (Car)和 50mg/L 潮 霉 素 的选择 培养基上进 行 第 一轮 选择 ,光照培养箱(30℃,24h 光照)中培养14 天。 2)将获 得 的抗 性愈伤转到 含 250mg/L...

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