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毕赤酵母表达实验手册

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毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而,许多蛋白质在翻译后,需经过翻译后的修饰加工,如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制,不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外,蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构,在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠,是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化,但不利于产物的活性,为了得到有活性的蛋白,就需要进行变性溶解及复性等操作,这一过程比较繁琐,同时增加了成本。大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统,当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的,其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物,不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力,其产物往住形成没有活性的包涵体,需要经过变性、复性等处理,才能应用。近年来,以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视,原因是与大肠杆菌相比,酵母是低等真核生物,除了具有细胞生长快,易于培养,遗传操作简单等原核生物的特点外,又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工,修饰,合理的空间折叠等功能,非常有利于真核基因的表达,能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。[1]。与大肠杆菌相比,作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母()在分子遗传学方面被人们的认识最早,也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981 年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因(参考文献?),随后又有一系列外源基因在该系统得到表达(参考文献?)。干扰素和胰岛素已大量生产并被广泛应用(大量生产是用什么方法生产的?是用酿酒酵母吗?),当利用酿酒酵母制备时,实验室的结果很令人鼓舞,但由实验室扩展到工业规模时,其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失(为什么?),质粒变得不稳定,拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素,因此拷贝数下降,也直接导致外源基因表达量的下降。同时,实验室用培养基成分复杂且昂贵,当采用工业规模能够接受的培养基时,导致了产量的下降。为克服酿酒酵母的局限,人们发展了以甲基营养型酵母(methylotrophicyeast 为代表的第二代酵母表达系统(最好加上年代...

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