疫苗生产实验方法

实验一 生产用毒种制备一、实验目的1. 掌握血凝（HA）实验的原理。2. 掌握病毒HA效价测定方法。3. 熟悉无菌操作采集尿囊液方法3. 了解常用的生产用毒种的制备方法。二、实验用品1. 器具：照蛋器、鸡胚孵化箱、超净台、注射器、EP 管、微量移液器、枪头、小烧杯、离心机、离心管、培养皿、96 孔反应板、恒温箱等。2. 试剂：生理盐水、1%鸡红细胞悬液。3. 实验材料：9 日龄鸡胚、未免疫过的鸡、新城疫种毒三、实验内容1. 参加实验的学生领取鸡胚，做好标记。2. 教师讲解实验过程及步骤并演示具体的实验操作技术。(1) 病毒增殖将已分装的种毒用生理盐水作10 -3 倍稀释，尿囊腔接种10 日龄鸡胚，每胚0.lmL。(2) 收集病毒病毒接种后24h ， 48h ， 96h 分别来检验并记录活死胚情况于表1 中，并及时弃去腐败胚。无菌操作方法釆集48-96h死亡胚及96h 活胚的尿囊液，收获前先将鸡胚置于4 ℃冷冻6-18小时，冷冻后的鸡胚钝端向上，将气室上方卵室用碘伏消毒除去，暴露壳膜，用无菌镊子小心将壳膜从绒毛尿囊膜上撕下，不要损伤绒毛尿囊膜。用注射器刺入尿囊腔，吸取尿囊液，置低温保存。可将若干胚液混合后测定血凝实验（HA）效价。(3)HA效价测定用微量移液器向96 孔反应板的第1-12孔各加生理盐水50uL。用灭菌的生理盐水将收集的鸡新城疫抗原50uL加入第一孔中，反复吹打 4-5 次后，吸出50uL到第二孔，依次倍比稀释到第11 孔，弃去50uL，病毒稀释倍数依次为1:2-1:2048，第12 孔不加抗原作为红细胞对照。用微量移液管向1-12个加1%的鸡红细胞悬液50uL。置于微量振荡器上，振荡1-2 分钟，室温静置15-20分钟后观察结果，记录于表2 中。结果判定：将反应板倾斜为45 度角，沉于管底的红细胞沿着斜面向下呈线状流动者，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集，如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能使100%红细胞凝集的病毒液的最高稀释倍数，称为该病毒液的红细胞凝集（HA）效价。 效价为使鸡红细胞完全凝集的病毒最大稀释倍数，为该病毒HA效价，HA效价用被检血清的稀释倍数或以2 为底的对数(log2)表示。HA效价在9(log2)以上者可用作制苗抗原。将合格的尿囊液保存于-20 ℃ --30 ℃冰柜中待用。3. 学生根据实验步骤进行实验操作。表 1 接种病毒后鸡胚的存活情况结果接种后时间胚胎总数活胚数死胚数死亡率 表 2 血凝实验(HA)观察结果孔号123456789101112 注：＃表示100%完全...