EMSA操作方法(原核表达纯化蛋白)VIP专享

三、凝胶滞留试验（）凝胶迁移滞留试验（electrophoreticmobilityshiftassays,EMSA）是研究核酸与蛋白质相互作用简单、快速、敏感的方法，目前已经成为转录因子研究的经典方法，并且用于研究 RNA 结合蛋白和特定的 RNA 序列的相互作用。其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的自由探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。（一）转录因子标签融合蛋白和标签蛋白的原核表达纯化以标签为例。裂解液：25mp.ris100ClaCl2ma、lm 和2lXCompleteProteaseInhibitorCocktail。洗脱液：50mp.ris2001C1aCllm>0.02（）riton1（和 10m 还原性谷胱甘肽。透析液：25mp.0ris、lnCla、lm 和 lXComplete2ProteaseInhibitorCocktail。1 将转化了 p4 载体或者 p4 目的基因重组载体的 L21 大肠杆菌在 5mL 含 100 卩 gmL 氨苄青霉素的 L 培养液中 3°C、200rpm 震荡培养 12h。2 取 1mL 菌液加入 100mL 含 100 卩 gmL1氨苄青霉素的 L 培养液中，3C、200rpm 震荡培养至为 00.5 左右。3 加入 IP 至终浓度为 0.5m,2C、200rpm 培养 h4 冰上放置 10min,4C、3000Xg 离心 15min，收集菌体并称重。5 每克菌体加入 3mL 裂解液，重悬菌体，加入溶菌酶至终浓度为 0.5mgmL,在冰上温和地搅动菌液 30min。超声波破碎 30s（破碎 10s 停 10s）。C、12000Xg 离心 30min，上清液用 0.45Mm 滤膜过滤，向滤液中加入5aCl 使 aC 啲浓度为 200m。去掉 ltathioneepharose4ast 中啲储存液，用 5 倍树脂体积的裂解液清洗树脂。待裂解液流到树脂上沿以下时，加入已过滤的菌体裂解液。流出液再过一次树脂，收集流穿液。0 用 5 倍树脂体积的裂解液清洗树脂，收集洗涤液并置于冰上。用 5 倍树脂体积的洗脱液洗脱目的蛋白，收集目的蛋洗脱液置于冰上。2 洗脱结束后，用 5 倍树脂体积的裂解液清洗树脂，收集清洗液置于冰上。用 5 倍树脂体积的双蒸水洗涤树脂，树脂保存于倍体积的 20（）乙醇中。通过电泳分析流穿液、洗涤液、目的蛋洗脱液和清洗液中出现的目的蛋白。5 用截留分子量不大于目的蛋白分子量的超滤管超滤纯化目的蛋白，并加入透析液继续超滤至合适的体积，转移到 5m 离心管中，29 保存。（二）蛋白质浓度的法测定用 m 公司生产的蛋白定量分析试剂盒测量蛋白质溶液的浓度。用透析液稀释 2000 卩 gmL 标准蛋白质溶液，得到浓度分别为 0、25、25250...