聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶实验报告

实验六 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶 一、研究背景 在生物学中，同工酶可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。动、植物的遗传变异可通过子代和亲代同工酶谱的比较来鉴别。法医学中也可用多种同工酶谱的分析来鉴定亲子关系。细胞杂交或植物杂交育种后是否出现新品种也可用周工酶谱的比较来确定。在个体发育中，从胚胎到出生，再到成年，随着组织的分化和发育，各种同工酶谱也有一个分化转变的过程。在植物的不同发育阶段，同样可见同工酶谱的相应改变。在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段，癌瘤组织的同工酶谱常发生胚胎化现象，即合成过多的胎儿型同工酶。如果这些变化可反映到血清中，则可利用血清同工酶谱的改变来诊断癌瘤。 所以，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的意义。过氧化物酶是植物体内普遍存在的活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用以及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。 二、实验原理 1、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理 系统的不连续性表现在以下几个方面： （ 1）凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。 （ 2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH 不同。本实验采用碱性系统。电极缓冲液为pH8.3的 Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7 的 Tris-HCl 缓冲液。而分离胶为pH8.9 的 Tris-HCl缓冲液。 （ 3）在电场中形成不连续的电位梯度。在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来、 以本实验要分离的小麦苗过氧化物酶同工酶为例，分别说明三种效应的作用： （ 1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。 （ 2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快；反之，分子量大、形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。 （3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。其原因如下： ① 由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。使得在该界面处的...