BcrAbl融合基因荧光定量RT

PML/RARα融 合 基 因 荧 光 RT-PCR 诊 断 试 剂 盒一、试剂盒采纳荧光定量RT-PCR 方法，快速、特异、灵敏、定量地检测临床白血病标本中PML/RARα融合基因的情况, 约有90%的急性早幼粒细胞白血病患者骨髓细胞和血细胞中会出现PML/RARα融合基因。因此检测PML/RARα融合基因已成为诊断急性早幼粒细胞白血病以及治疗后追踪剩余白血病细胞的主要依据。二、试剂盒组成(20 人份)RNA提取液 〔20ml / 瓶〕1 瓶Taq酶 〔40μl / 管〕1 管反响液I 〔165μl /管〕1 管定量标准品 〔50μl / 管〕8 管反响液II 〔165μl /管〕1 管DEPC H2O 〔500μl /管〕1 管反响液Ⅲ 〔350μl /管〕1 管去离子水 〔1100μl / 管〕1 管逆转录酶 〔25μl / 管〕1 管三、检测步骤 1 ．标本采集抽取外周血5ml 抗凝后密封送检，或3ml 新奇骨髓标本密封送检。2 ．标本处理将5ml 抗凝外周血或3ml 骨髓参加等体积生理盐水稀释，取10ml离心管，先参加2ml 淋巴细胞别离液，再取稀释好的标本5ml 沿管壁缓慢参加，4℃ 静置5 分钟后，2,000rpm离心15分钟，小心吸取白细胞层于离心管中，离心留沉淀，用生理盐水洗沉淀一次，沉淀参加ml RNA 提取液，充分混匀。室温静置5 分钟，参加氯仿，盖上管盖，用力振摇15秒，4℃ 静置2-3 分钟，4 12,000rpm℃离心15分钟， 离心后反响管分三层，底层为微黄色的氯仿层，中间层及无色水相上层，水相上层的体积一般为提取液体积的60%。小心将上层水相转移至灭菌的离心管中，加等体积异丙醇4℃ 静置10分钟，然后4℃ ，12,000rpm 离心10分钟，离心前通常看不见RNA沉淀，离心后可见胶状沉淀。去上清，参加400μl 75% 的乙醇洗涤RNA沉淀，混匀，4 7,000 rpm℃离心5 分钟，小心吸去大局部乙醇。将沉淀在室温空气中枯燥10分钟。( 注： 75% 乙醇配制时须用试剂盒中提供的DEPC H2O 〕。用40μl DEPC H2O 溶解沉淀，吸出局部溶液，测A260-A280处的吸光值，并计算RNA含量。3 ．逆转录反响：取灭菌0.5ml 离心管, 按以下要求配备逆转录体系反响液I逆转录酶模板〔RNA〕DEPC H2O总反响体积μl1μl2μg〔或5μl 〕7.5μl20μl反响条件：37℃水浴60分钟。4 ．第一步PCR扩增：取灭菌0.2ml PCR 反响管, 按以下要求配备PCR体系反Taq 酶模板去离子总反响响液II〔cDNA 〕水体积μlμl5μl13μl25μl反响条件：94→4℃分钟预变性, 然后按94 30℃秒→54 30℃秒→72 60℃秒, 共做2...