慢病毒包装步骤

慢病毒(过表达）包装步骤秦超1.转染复苏 293T 细胞,传 2-3 代进行转染，转染推举使用合元公司的慢病毒转染试剂.转染步骤:（以 10cm 培育皿为例)⑴最好在铺细胞后 20h 左右进行转染，控制转染前细胞密度 70％—90％,保证细胞处于良好的状态，转染前一小时把一半培育基(约 5ml）换成新的（含血清,因为此转染试剂不需换液）。⑵加 psin 10ug，pspax2 10ug，pmd2。g 5ug 于 800ul opti—mem,混匀⑶加 40ul 慢病毒转染试剂于 800ul opti—mem,混匀,室温静置 5min⑷将⑶所得的转染试剂稀释液滴加到⑵所得到的质粒稀释液中，边加边轻轻混匀，室温放置 20min⑸取出细胞培育皿，将⑷得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培育基中，前后轻轻推摇使混合均匀，放回培育箱。2.收毒（36—48h)收毒前假如质粒带有荧光标签可先看一下转染效率，一般达到 60％即可。⑴将培育皿中的病毒上清液吸出到 15cm 离心管中，然后 2000rpm 离心 10min，以沉淀细胞碎片.⑵取上清用 0.22um 滤清过滤到浓缩管（用蛋白质浓缩管即可）中。4000rpm 离心至所需体积。⑶浓缩完毕后,吸出浓缩后的病毒液，按每次的接毒量分装，—80℃冻存。由于反复冻融会降低慢病毒滴度，因此避开反复冻融。3.接毒接毒前 12—20h 铺细胞,使接毒时细胞密度约为 40%-50%，务必使用生长状态良好的细胞。将分装好的慢病毒滴加到细胞中，加 polybrene 使其终浓度为 8ug/ml细胞密度 60％—70％时可以再接毒一次。4.检测及培育细胞系（48h)假如带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率，如需用药杀用 puromycin 杀三天(对比组完全杀死），剩下的即为基因整合进去的细胞。如需培育成细胞系，可继续培育。假如剩下的细胞较少可用高浓度血清，待细胞聚团时用胰酶消化一下，使细胞铺匀。