基于ARTP和适应性进化选育高抗逆性凝结芽孢杆菌及其发酵豆粕的研究论文设计

摘 要凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）是一种兼具乳酸菌和芽孢杆菌优势的益生菌，相比于其他菌群，其芽孢体对热、酸、碱、盐等不敏感，可经受高温加工、胃肠道酸碱环境，有效降低染杂菌风险，目前已成为饲料领域微生态制剂的优势菌群之一。然而，并非所有天然存在的凝结芽孢杆菌都对酸、碱、盐等压力环境具有优良的抵抗性能。因此，在前期已成功从健康猪肠道内容物分离纯化并鉴定出一株凝结芽孢杆菌，命名为 WT-03 的基础上，本研究利用常压室温等离子体诱变(Atmospheric and room temperature plasma, ARTP) 结合适应性进化 (Adaptive laboratory evolution, ALE ) 策略对其进行抗逆性能改善，筛选具备耐酸、耐胆盐等高抗逆性的目的菌株，并从胞内微环境、细胞结构以及细胞膜层面对其抗逆性机制进行初步探究；最后，将其用于固态发酵豆粕，优化发酵条件，对发酵前后的营养品质进行评价。主要研究内容有：（1）采用 ARTP 结合适应性进化选育了耐酸、耐胆盐的高抗逆性凝结芽孢杆菌。ARTP 最优照射时间为 15s，致死率 93.84%。利用含 0.3%(w/v)胆盐的 MRS筛选培养基对诱变 15s 的菌体进行初筛，得到 30 株生长态势良好、菌落较大的突变株 artp-BC1、artp-BC2……artp-BC30。之后，利用盛有 pH4.0、pH3.5 和 pH3.0 的24 孔板液体培养基对初筛菌进行复筛，最终得到 artp-BC5、artp-BC15、artp-BC28三株突变株，在 pH3.0 存活率显著高于野生株，分别为 18.2%、18.8%和19.3%。40d 的梯度酸驯化实验显示，artp-aleBC15 在 pH2.5 存活率最大，为19.8% ； 而 对 照 菌 WT-03 仅 为 7.15% 。 体 外 模 拟 胃 肠 道 实 验 表 明 ， artp-aleBC15、artp-BC15 和 WT-03 最终存活率分别为 20.5%、15.2%和 7.98%。因此 ，artp-aleBC15 为 理 想 菌 株 ， 已 存 于 中 国 工 业 微 生 物 菌 种 保 藏 中 心 ， 编 号CGMCC1.17145。（2）从胞内微环境变化、细胞结构和细胞膜水平对凝结芽孢杆菌突变株和野生株的耐酸性机理进行了探究。外界酸胁迫导致胞内 pH（pHi）降低，pH6.2 时artp-aleBC15、artp-BC15 和对照组 WT-03 的 pHi 均在 7.10 左右；而 pH2.5 时，突变株 artp-aleBC15、artp-BC15 和对照株 WT-03 的 pHi 分别为 4.90、4.45 和 4.23。扫描电镜结果表明，artp-aleBC15 在 pH2.5 环境能更好的保持结构完整性。细胞膜水平的分析...