表达载体的构建方法及步骤

表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类，其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点.（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段(4) P/E 启动子/增强子(5）Terms 终止信号（6）加 poly(A）信号可以起到稳定 mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的,同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。假如构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体.载体选择主要考虑下述 3 点：【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型：(1)克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）.如〈10kb 选质粒。（2)表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E。coli/哺乳类细胞表达载体.（3)对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌,用于表达真核蛋白质时注意克服 4 个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考.【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。综上所述，选用质粒（最常用）做载体的 5 点要求:（1）选分子量小的质粒,即小载体（1－1。5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2)一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般 10 个以上的拷贝，而严谨型质粒<10 个。(3）必需具备一个以上的酶切位点,有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因,不特指多位 Ampr（试一试)。（5)满足自己的实验需求,是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性(如 Puro、G418）等等。无论选用哪种载体,首先都要获得载体分子，然后采纳适当的限制酶将载体 DNA 进行切割，获得线性载体分子,以便于与目的基因片段进行连接.如何阅读质粒图谱第一步：首先看 Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记,如抗性，决定使用什么筛选标记.（1)Ampr 水解 β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。（4）neor(...