蛋白质印迹(Western blot)样品制备VIP专享

蛋白质印迹（Westernblot）样品制备蛋白质印迹样品制备，包括裂解缓冲液、细胞培养物裂解物、组织裂解物的制备以及蛋白质浓度的测定。目录•裂解缓冲液•蛋白酶和磷酸酶抑制剂•制备细胞培养物裂解物•制备组织裂解物•测定蛋白质浓度•制备用于凝胶上样的样品：变性样品和天然样品，还原样品和非还原样品裂解缓冲液不同裂解缓冲液溶解蛋白质的能力各不相同，其中含有十二烷基硫酸钠（SDS）和其它离子去污剂的裂解缓冲液被认为具有最强的溶解能力，因此最有可能获得最高得率。选择裂解缓冲液的主要考虑因素是确保所选抗体能够识别变性样品。如果抗体无法识别变性样品，抗体数据表会加以说明，这种情况下应使用不含去污剂或含有相对温和的非离子去垢剂（NP-40、TritonX-100）的裂解缓冲液。蛋白质位置及相应裂解缓冲液的选择蛋白质位置推荐缓冲液全细胞NP-40细胞质（可溶）Tris-HCI细胞质（细胞骨架结合）Tris-Triton膜结合NP-40 或 RIPA细胞核RIPA 或采用细胞核结构组分实验方案*线粒体 RIPA 或采用线粒体结构组分实验方案**专门或主要存在于亚细胞结构位置的蛋白质在亚细胞结构组分裂解物中的富集程度高于全细胞或组织裂解物。这对于试图获取弱表达蛋白的信号非常有用请参阅我们的亚细胞组分分离实验方案。裂解缓冲液配方:NP-40 缓冲液 •150mM 氯化钠•1.0%NP-40（可用 TritonX-100 替代 NP-40）•50mMTris,pH8.0这是研究细胞质蛋白、膜结合蛋白或全细胞提取物的常用一种缓冲液。如果担心目标蛋白不能从不溶材料或聚集体中完全提取出来，那么利用 RIPA 缓冲液更适合，因为其中所含的离子去垢剂更容易使蛋白质溶解。RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀分析缓冲液） •150mM 氯化钠•1.0%NP-40 或 TritonX-100•0.5%脱氧胆酸钠*•0.1%SDS（十二烷基硫酸钠）•50mMTris，pH8.0*可制备成 10%的母液，避光保存。RIPA 缓冲液适用于全细胞提取物和膜结合蛋白，而且其提取细胞核蛋白的效果比仅含 NP-40或 TritonX-100 的缓冲液的效果更好。但它会破坏蛋白质与蛋白质的相互作用，因此可能会给免疫沉淀分析和 pull-down 实验带来一些问题。如需保护蛋白质与蛋白质的相互作用，或需最大限度避免蛋白质变性，应使用不含离子去垢剂（例如 SDS）的缓冲液，理想的缓冲液中还不应含有非离子去垢剂（例如 TritonX-100）。使用不含去垢剂的缓冲液制备细胞裂解物时需进行机械剪切操作，通常利用 Dounce 匀浆器或使细胞通过注射器针头来完成此操...