齐鲁医学大肠杆菌培养基配制及培养方法

大肠杆菌培育一、菌种冻存液的制备含有足量细菌的液体培育基离心后在沉淀中加入等量 40%甘油，-80oC 冻存。二、培育基制备LB 培育基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH7.4）液体培育基胰化蛋白胨 10.0g酵母粉 5.0g氯化钠 10.0g水 1000mlpH7.4固体培育基在液体培育基的基础上再加入 1.5％－2.0％的琼脂三、平板的制备1） 称取胰化蛋白胨 10.0g，酵母粉 5.0g，NaCl10.0g，加入 800mL 二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用 1mol/L 的 NaOH 调 pH 至 7.4 左右，定容至 1L，调pH7.4（若溶液 pH 大于 7.4，用 1mol/L HCl 回调）。2） 分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。如需固体培育基在分装后的液体培育基内加入约 2%的琼脂（150mL 液体培育基加入 2.5g 琼脂）。3） 在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。所有锥形瓶如上述操作。用记号笔注明培育基名称、配制日期。4） 高压蒸汽灭菌锅 121 oC 灭菌 15min。5） 灭菌后的培育基取出置电热鼓风干燥器内 60oC 烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。液体培育基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培育基不会凝固，可在预先紫外杀菌 30min 以上的无菌操作台上，将培育基倒入培育皿内，每个培育皿培育基约 10-15mL（直径 90mm），在培育皿中厚度大约 4mm 左右。将平皿叠放在无菌操作台上，放置 10min 左右，待琼脂基本凝固可涂平板。6） 若平板不直接使用，灭菌后将培育基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约 3min，使琼脂熔化，室温冷却 20min 至不烫手可制备平板。四、接种大肠杆菌1） 取实验室储备的大肠杆菌 BL21 冻存液， 管口用酒精灯灼烧，打开离心管。2） 接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取 100uL 溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。3） 因实验一般都要求挑取单菌落，故涂平板适应考虑冻存液内细菌数量，若菌量过大应适当稀释。一般方法一获得单菌落的可能性比较大。涂平板应在酒精灯附近进行，若冻存液涂完的平板应倒置，防止平皿盖上产生水蒸气。五、大肠杆菌的培育1）将接种好的平皿倒置放入 37℃的恒温培育箱中培育，大约十几小时后长出菌落。2）挑取生长状态好，特征明显的单个菌落，接种于新奇灭菌的 LB 液体培育基中 37℃，220rpm/min 恒温振荡培育 9-12h。菌落特征：乳白色，圆形，菌落边缘整齐，表面光滑，表面和背面颜色一致。