各种酶活性测定方法第一超氧化物歧化酶 SOD 测定一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生 02，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在 560nm 处有最大吸收。而 SOD 可清除 02,从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为 4OO0LX）；5.试管或指形管数支。（三）试剂 1.0.05mol/L 磷酸缓冲液（）；2.130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称用磷酸缓冲液定容至 100ml；|imol/L 氮蓝四唑溶液：称取用磷酸缓冲液定容至 100ml，避光保存；4.100ymol/LEDTA—Na2溶液：称取一 Na2用磷酸缓冲液定容至 1000ml；5.20pmol/L 核黄素溶液：称取 0.0753g 核黄素用蒸馏水定容至 1000ml 避光保存。三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g 于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为 5ml。取〜2ml 于1000rpm 下离心 20min,上清液即为 SOD 粗提液。2. 显色反应取 5ml 指形管（要求透明度好）4 支，2 支为测定管，另 2 支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）L 磷酸缓冲液 LMet 溶液 L750^mol/LNBT 溶液 ymol/L1O0ymol/LEDTA—Na2液 ymol/L20ymol/L核黄素 ymol/L 酶液支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水总体积混匀后将 1 支对照管置暗处，其它各管于 4000Lx 日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。3. SOD 活性测定与计算至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。四、结果计算已知 SOD 活性单位以抑制 NBT 光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD 活性。SOD 总活性=（Ack—AE）xV/（AckxxWxVt）°上式中，SOD 比活力=SOD 总活性蛋白质含量式中 SOD 总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位/mg 蛋白表示 Ack 照光对照管的吸光度 AE 样品管的吸光度 V 样品液总体积...
