检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术

一、检测蛋白质与蛋白质相互作用① F Ｒ E Ｔ技术(ｉ n ｖ i ｖ o) Ｆ RET,F ｌ uorescence reso ｎ ance ｅ ner ｇ y transfe ｒ,即荧光共振能量转移技术。该技术得原理就就是用一种波长得光激发某种荧光蛋白后,她释放得荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白,使其释放另一波长得荧光,如下图所示: 以下图为例,若要利用Ｆ RE Ｔ检测两种蛋白就就是否有相互作用,需将两种蛋白得基因分别与这两种荧光蛋白得基因融合,并在细胞内表达出两种融合蛋白。然后只需用紫外光对 CFP 进行激发,并检测 GFP 就就是否放出绿色荧光假如能检测到绿色荧光,那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用;反之,则就就是这两种蛋白没有相互作用。② 酵母双、三杂交技术(in ｖ ivo)酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白就就是否有相互作用,其原理就就是典型得真核生长转录因子,如 GAL4、GCN4 等都含有二个不同得结构域,即 AD和Ｂ D。这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。由此 ,设计不同得两个载体,一个含有 AD 基因(假设为 A 载体),另一个含有Ｂ D 基因(假设为B 载体)。一般将一个已知蛋白得基因连在 B 载体上,作为诱饵(Bai ｔ),将未知蛋白得基因连在 A 载体上,将这两个载体都转到特定得酵母细胞内,看未知蛋白与已知蛋白就就是否有相互作用。假如两者有相互作用,那么就可以启动报告基因得转录,从而使这个酵母细胞能在选择培育基上显现出来或者生存下来;假如两者无相互作用,那么报告基因就无法表达,那么这个酵母细胞就无法在择培育基上显现出来或者生存下来,如下图所示: 由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间得相互作用,因此又进展出了分离泛素酵母双杂交系统。该系统得原理如下图所示:如图所示,将泛素蛋白拆分为两个片段,即 C 端段(Ｃｕｂ)和 N 端段(NubG),并在 C 端段得 N 端接上一个 LexA－V Ｐ 16 转录因子,此时她并不能激活基因转录(因为她被限制在了 C 端段上,不能进入细胞核发挥作用)。将该 C 端段连到一个膜蛋白上,将 N 端段连接到另一个膜蛋白上。若两个膜蛋白有相互作用,那么两个膜蛋白在相互靠近时会使泛素蛋白得Ｎ端段和 C 端段靠近结合,形成一个完整得泛素蛋白。此时泛素蛋白酶体会将这一段被泛素标记得片段降解,那么连接 C 端段得Ｌ exA－V Ｐ 16 转录因子掉落,即可进入细胞核启动标记基因得表达。酵母三杂交得原理与双杂交一样,只就就是她讨论得就就是两个蛋白和第三个成分...