管碟法测定抗生素效价一、目的和要求1、了解管碟法的原理。2、掌握二剂量法测定抗生素效价单位的技术和计算方法。二、原理抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点。管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，作为法定的抗生素生物检定方法。当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系。三、实验材料1、四环素类抗生素的标准品和样品。2、试验菌：藤黄八叠球菌（Sarcinalutea）。3、培养基：250ml三角瓶分装150mlLB琼脂，150ml三角瓶分装50mlLB琼脂，50ml三角瓶分装20ml藤黄八叠球菌悬液用培养液。4、灭菌物品：培养皿，牛津杯（内径：6.0±0.1mm，外径：7.8±0.1mm，高度：10.0±0.1mm），滴管，1ml吸管，pH6.0的磷酸缓冲液，弯头镊子，15×150mm试管，瓦盖。5、其它：分析天平，容量瓶，玻璃板，水平仪，游标卡尺。四、实验实施1、配制标准品溶液2、配制样品溶液3、制备菌悬液。4、制备平板：（1）取6套无菌培养皿，分别加入约20mlLB培养基后，置水平玻璃板上凝固，作为底层。（2）另取冷却至50℃左右的50mlLB培养基，加入1ml试验菌悬液，迅速摇匀后，用10ml破口吸管取6ml混菌培养基倒在底层平板上，作为菌层，并放置在水平玻璃板上凝固。5、在培养基平板底部作好相应标记，用弯头镊子在每个培养皿中等距离放入4个牛津杯。6、用滴管分别将高、低浓度的标准品和样品溶液加入到牛津杯中，以滴满为度，换上皿盖。7、将培养皿平稳送入恒温箱，37℃下培养16～18h。实验四十四抗生素效价的生物测定实验四十四抗生素效价的生物测定一、目的要求学习了解抗生素效价的生物测定（管碟法）的基本原理和方法。二、基本原理某些微生物在代谢过程中所产生的次级代谢产物能在低浓度的情况下抑制或杀死某些微生物，这种物质称为抗生素。抗生素效价的生物测定有稀释法、比浊法、扩散法三大类。管碟法是扩散法中的一种，本法是利用抗生素在琼脂培养基的扩散渗透作用，将已知浓度的标准溶液与未知浓度的样品溶液在含有敏感性试验菌的琼脂表面进行扩散渗透，比较两者对被试菌的抑菌作用，求出抑菌圈的大小，以测定抗生素的浓度。在一定范围内，浓度与抑菌圈直径在双周半对数表上（浓度为对数值，抑菌圈直径为数字值）成直线函数的关系，由此绘制成标准曲线，从样品的抑菌圈大小可在标准曲线上求得其效价。由于本法是利用抗生素抑制敏感细菌的特点，所以符合临床使用的实际情况，而且灵敏度也很高，不需特殊设备，故一般实验室及生产上多采用此法。但此法也有缺点，即操作步骤多，手续繁杂，培养时间长、得出结果慢。尽管如此，由于它有上述的独特优点而被世界各国所公认，成为国际通用的方法被列入各国药典法规的范围内。本实验以龟裂链霉菌（Streptomycesrimosus）产生的土霉素效价测定为例。三、器材黄色八叠球菌（Sarcinaflava）；（土霉素效价测定用）培养基，（供培养试验菌用）培养基Ⅰ，（供摊布双碟的上、下层用）培养基Ⅱ；培养皿，牛津杯（或不锈小钢管），陶瓦圆盖，50ml、250ml、1000ml容量瓶，0．1mol/LHCl，土霉素标准品等。四、操作步骤1．pH6．0磷酸缓冲液的配制准确称取KH2PO40．8g和K2HPO40．2g，置100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，灭菌备用。2．标准土霉素溶液的配制精确称取20mg土霉素标准品，每毫克含880单位（880r/mg），先用0．1mol/LHCl溶解（按称量每10mg加酸1ml），然后加入无菌蒸馏水稀释成每毫升含1000单位（1000r/ml）的溶液，此液在5℃以下保存。3．被测样品溶液的制备精确称取样品20mg左右，先用0．1mol/LHCl2ml溶解，然后再用无菌蒸馏水稀释成估计每毫升含1000单位，再吸取1ml至50ml容量瓶中加pH6．0磷酸缓冲液至刻度，稀释成估计每毫升含20单位的样品溶液。4．黄色八叠球菌菌液的制备取每周接种一次、用普通琼脂斜面保存的黄色八叠球菌菌...
