一、目得基因克隆得策略有哪些？其理论依据什么？如何根据具体条件,如目得性状得特点,已知控制目得性状得基因得信息合理选择基因克隆得方法？1、主要有以下几个克隆得策略:(1)PCR 法分离目得基因:从蛋白质得一级序列分析得到核酸序列得相关信息,设计简并引物,通过对 mRNA 进行反转录得到 cDNA,以 cDNA 为模板,然后将目得基因通过 PCR 方法扩增,或者直接从基因组 DNA 扩增得方法。(2)核酸杂交得方法:通过对蛋白质得氨基酸序列分析,设计简并引物,通过核酸杂交得方法从基因文库中筛选得到目得基因。(3)免疫学筛选法分离目得基因:利用免疫学原理,通过目得蛋白得特异抗体与目得蛋白得专一结合,从表达文库中分离目得蛋白基因。2、若控制该性状得目得蛋白质不容易分离纯化,这 PCR 方法比较适宜,若蛋白质分离纯化容易,且有现成得基因文库,则后两种方法较为简单。二、蛋白组学方法克隆目得基因得理论依据就是什么？有哪些技术环节？要用到哪些技术？1、理论依据:以分离纯化得目得蛋白为讨论起点,通过对目得蛋白得一级结构分析,获得起码得氨基酸序列信息后,反推可能得 DNA 序列,然后设计引物,从 cDNA中将目得基因扩增出来,或者设计核酸探针,通过杂交技术将目得基因从基因文库中筛选出来。或通过抗体抗原免疫反应从表达文库中将该基因分离出来。2、技术环节就是确定并制备出高纯度得蛋白质。3、所需要得实验技术有:蛋白质得双向电泳技术,由第一向得等电聚焦电泳与第二向得 SDS-PAGE 电泳组成;蛋白质氨基酸序列分析。三、基因组学方法克隆基因得策略有哪些？各有什么特点？如何选择恰当得基因组学方法克隆目得基因？1、基因文库筛选方法通过对基因文库得筛选将目得基因分离出来,一般有两种方法:核酸杂交法,原理就是分子杂交; PCR 筛选法,通过ＰＣＲ方法将目得基因分离出来,对于以混合形式保存得文库,先将文库分成几份,每份为一个“反应池”进行 PCR 反应,待选出阳性池后,将阳性池得混合克隆稀释,然后等量分置 96 孔板中,进行横向池及纵向池得ＰＣＲ反应,然后将阳性菌落群进行稀释,重复上述工作,直到筛出阳性单克隆。2、图位克隆目得基因利用分子标记技术对目得基因进行精细定位,利用分子标记技术对目得基因进行精细定位,用获得得与目得基因紧密连锁得分子标记筛选基因文库得方法。主要有染色体步移法、染色体登陆、跳查与连接法;外显子捕捉与 cDNA 直选法等。3、插入突变分离克隆目得基因由重组 DNA 技术衍生出得插入突变,可人为地...
