叶绿素含量的测定叶绿素含量的测定 一、 实验目的 1. 了解分光光度计的工作原理； 2. 掌握不同型号分光光度计的操作方计； 3. 通过本实验的学习掌握叶绿素含量测定的一种常见的方法------分光光度 法。 二、 实验原理 叶绿素是脂溶性色素，主要存在于以叶绿体为首的色素体中。在活体中，叶绿素与脂蛋白结合并受到还原系统的保护，对氧和光是稳定的。 叶绿素的 80%丙酮提取液在波长 663nm，645nm 有吸收峰，叶绿素 a 和叶绿素b 的浓度符合以下公式： Ca=0.0127A663-0.00259A645 Cb=0.0229A645-0.00467A663 浓度单位是：g/L Ca=12.7A663-2.59A645 Cb=22.9A645-4.67A663 浓度单位是：mg/L 叶绿素总浓度为： CT=Ca+Cb 若以试液中色素含量来表示，则 C(mg/L)?提取液总体积(ml)叶绿素含量（mg/g 鲜样）? 样品重(g)?1000 三、 仪器、试剂和材料 1. 仪器 紫外-可见分光光度计、研体、25ml 容量瓶、玻璃漏斗、玻璃棒、皮头滴管 2. 试剂 丙酮（分析纯）、85%丙酮、80%丙酮 2. 材料 滤纸、石英砂、碳酸镁 四、 操作步骤 1. 在遮光条件下取出等测样品，剪碎，混匀，称取鲜样 0.1-0.5g； 2. 样品置于研钵内，加入少量碳酸镁和石英砂，加入一定体积的丙酮研磨匀浆，再加 85%丙酮适量继续研磨至组织白色； 3. 经铺有滤纸的漏斗将匀浆液转入 25ml 的容量瓶中，并用 80%的丙酮分次清洗研钵和滤纸，最后用 80%的丙酮定容。 4. 以 80%的丙酮为参比液，在 663 和 645nm 波长处测定吸光值（A 应在 0.2-0.8 范围内，浓度过大应用 80%丙酮适当稀释）。 五、 结果处理 根据公式计算出叶绿素 a 和叶绿素 b 的浓度，再计算出叶绿素的含量。 六、 注意事项 1. 在活体内，结合态叶绿素是稳定的，组织一经破坏，叶绿素易被光解。因此，抽提和测定工作应尽可能避光快速完成。 2. 对含有大量酸性液泡的样品，应首先加入微碱性的缓冲液，认真研磨后加入丙酮进行抽提。 3. 分光光度计的精度对测定的结果有至关重要的影响，使用前对仪器进行校正。 七、思考题 1. 当溶液中有两种成分共存时，利用分光光度计进行测定时，如何选择测定波长？ 附属实验： 1. 溶剂极性对有机物精细结构影响 苯-环己烷、苯-乙醇、苯-水 2. 溶剂pH 对光谱的影响 苯酚、苯酚—H+（pH=6）、苯酚—OH-（pH=10）
