01-蛋白质的表达、分离、纯化实验VIP专享

蛋白质的表达、分离、纯化实验蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探究和讨论基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的讨论；（3）作为催化剂、营养剂等。实验方法原理携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌 BL21 中，在 37℃，IPTG 诱导下，超量表达携带有 6 个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。实验材料：大肠杆菌 BL21试剂、试剂盒：LB 液体培育基、氨苄青霉素、Washing BufferElution BufferIPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠仪器、耗材：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒实验步骤一、试剂准备 1. LB 液体培育基：Trytone 10 g， yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸馏水配至1000 mL。 2. 氨苄青霉素：100 mg/mL。 3. 上 样 缓 冲 液 ： 100 mM NaH2PO4 ， 10 mMTris ， 8M Urea ， 10 mM 2-ME，pH8.0。 4. Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8 M Urea，pH6.3。 5. Elution Buffer ： 100 mM NaH2PO4 ， 10 mMTris ， 8M Urea ， 500 mM Imidazole， pH8.0。 6. IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG 溶于 100ml ddH2O 中,0.22μm 滤膜抽滤，-20℃保存。二、获得目的基因 1. 通过 PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。 2. 通过 RT-PCR 方法：用 TRIzol 法从细胞或组织中提取总 RNA，以 mRNA 为模板，逆转录形成 cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行 PCR 循环获得产物。 三、构建重组表达载体 1. 载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收 Kit 或冻融法回收载体大片段。 2. PCR 产物双酶切后回收，在 T4DNA 连接酶作用下连接入载体。 四、获得含重组表达质粒的表达菌种 1. 将连接产物转化大肠杆菌 DH5α，根据重组载体的标志（抗 Amp 或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2. 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则...